Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему: Крымская-Конго геморрагическая лихорадка: клинико-патогенетические аспекты и оптимизация лечения

Автореферат диссертации по медицине на тему Крымская-Конго геморрагическая лихорадка: клинико-патогенетические аспекты и оптимизация лечения

На правах рукописи

САВИНКОВА ИРИНА ВИКТОРОВНА

КРЫМСКАЯ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКАЯ ЛИХОРАДКА: КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ОПТИМИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ

14.00.10 - инфекционные болезни 14.00.05 - внутренние болезни

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования ««Ставропольская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

доктор медицинских наук, профессор,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Малеев Виктор Васильевич Пасечников Виктор Дмитриевич

Островский Николай Николаевич Лучшее Владислав Иванович Шешулин Аркадий Александрович

ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится «_»_ 2009 г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208.114.01 при ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» по адресу: 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. ЗА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора».

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Горелов Александр Васильевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка (ККГЛ) - эндемичное, зоонозное, острое инфекционное заболевание, вызываемое одноцепочечным РНК-вирусом, относящимся к экологической группе арбовирусов (род Nairovirus, семейство Bunyaviridae) переносчиком которого являются иксодовые клещи [Львов Д.К. и соавт., 1989]. ККГЛ характеризуется высокой лихорадкой и развитием в большинстве случаев геморрагического синдрома (ГС) различной степени тяжести [Чумаков М.П., 1979; Лазарев В.Н., 1973; Ergonul О., 2006].

Актуальность исследования ККГЛ обусловлена несколькими обстоятельствами. Изменение социальных, экономических и климатических факторов (миграции людей, биотерроризм, нарушение экологии среды), нозокоми-альные вспышки заболевания [Айдинов Г.Т. и соавт., 2002; Fisher-Hoch S.P., 2005] могут способствовать распространению инфекции ККГЛ в новых ареалах и увеличению заболеваемости в эндемичных районах [Онищенко Г.Г., Ефременко В.И., 2005; Jaureguiberry S., 2005; Smego R.A. et al., 2004]. ККГЛ является эндемичным заболеванием для нескольких регионов Южного федерального округа, и в том числе - Ставропольского края, в котором резервуаром и основным переносчиком вируса ККГЛ является пастбищный клещ Н. Marginatum [Онищенко Г.Г. и соавт., 2005]. Увеличение численности и расширение ареала переносчиков инфекции в ландшафтно-географических зонах Ставропольского края, отсутствие эффективных мер по истреблению клещей и изменению условий труда людей, занятых животноводством, обусловили рецидив ККГЛ после периода длительного благополучия [Онищенко Г.Г., 2001; Львов Д.К., 2002]. В Ставропольском крае за период с 1999 по 2008 гг. вирусной инфекцией были поражены 426 человек, что составило 35% от числа всех заболевших в Южном федеральном округе [Государственный доклад УФС Роспотребнадзора по Ставропольскому краю «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Ставропольском крае в 2008 году»].

Важным аспектом актуальности проблемы ККГЛ является стремительное развитие симптоматики и потенциально высокий уровень смертности, варьирующей от 3 до 80% [Schwarz T.F. et al., 1997; Whitehouse С.А., 2004; Vorou R. et al., 2007], что предопределяет необходимость прогнозирования неблагоприятного исхода заболевания и разработку адекватного лечения.

Актуальность изучения ККГЛ в Российской Федерации обусловлена отсутствием сведений о факторах риска и предикторах фатального исхода заболевания, позволяющих врачу не только оценить прогноз, но интенсифицировать терапию, целью которой является борьба за сохранение жизни пациента. Зарубежные исследователи рассматривают ряд факторов риска - потенциальных предикторов фатального исхода заболевания (высокая вирусная

нагрузка, супрессия ответа иммунной системы на циркуляцию вируса в организме, вовлечение в патологический процесс клеток-, органов- и тканей-мишеней, массивный выброс цитокинов, развитие профузных кровотечений, нарушение гомеостаза крови и процесса свертывания, угнетение функции печени, наличие признаков развивающейся полиорганной недостаточности) [Swanepoel R. et al., 1989; Papa A. et al., 2006; Burt F.J. et al., 1997; Ergonul O. et al., 2006; Duh D. et al., 2007].

Актуальным направлением исследования ККГЛ является обоснование оптимальной терапии, позволяющей решить проблему высокой смертности больных. До недавнего времени лечение большинства вирусных геморрагических лихорадок (ВГЛ) и ККГЛ, в том числе, осуществлялось с помощью адекватного восполнения объема циркулирующей жидкости, количества эритроцитов и тромбоцитов, т.е. дополнительными мерами (вспомогательная или заместительная терапия) [Handy J. М, 2004; Whitehouse С. А., 2004]. Поскольку опыт применения противовирусной терапии (рибавирина) в мировой практике ограничивается небольшими когортами больных, оценка его эффективности достаточно противоречива [Tang, М. et al., 2003; Ergonul О., 2006; Ozkurt Z. et al., 2006]. Проведенные исследования не позволили определить эффективность терапии рибавирином (снижение смертности, обратное развитие симптомов, воздействие на продукцию факторов воспаления и восстановление гомеостаза) в зависимости от сроков его назначения, уровня вирусной нагрузки, статуса иммунной системы, формы препарата.

Таким образом, увеличение распространения инфекции, тяжелое течение заболевания с высоким уровнем смертности, противоречивость в оценке эффективности противовирусной терапии придают вирусу ККГЛ статус важного человеческого патогена.

В этой связи исследование клинических и патогенетических аспектов ККГЛ является актуальным и необходимым направлением научных исследований, прежде всего для практического здравоохранения.

Цель исследования: изучение клинических и патогенетических особенностей ККГЛ на современном этапе, прогнозирование исходов заболевания, оценка диагностических методов и оптимизация терапии.

1. Дать характеристику циркуляции вируса ККГЛ в крови больных, формирования специфического противовирусного ответа в различные периоды развития заболевания в зависимости от наличия/отсутствия противовирусного препарата (рибавирина) в схеме терапии.

2. Определить значимость полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и методов иммуноферментного анализа в диагностике ККГЛ.

3. Охарактеризовать воспалительный ответ больных на инфицирование вирусом ККГЛ посредством исследования профиля цитокинов в крови в различные фазы развития заболевания в сопоставлении с клиническими данными и наличием/отсутствием противовирусного препарата (рибавирина) в

4. Исследовать состояние клеток- и органов-мишеней в различные периоды развития заболевания в сопоставлении с клиническими данными, исходами ККГЛ и наличия/отсутствия противовирусного препарата (рибавири-на) в схеме терапии.

5. Дать развернутую характеристику клинических и лабораторных проявлений геморрагического синдрома, определить патогенетические особенности формирования синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания в различные периоды ККГЛ в зависимости от тяжести, исходов заболевания и наличия/отсутствия противовирусного препарата (рибавирина) в схеме терапии.

6. Провести анализ особенностей течения ККГЛ и её исходов в зависимости от наличия/отсутствия противовирусного препарата (рибавирина) в схеме терапии. Исследовать критерии развития полиорганной недостаточности и ее структуру, установить факторы риска и предикторы фатального исхода заболевания.

7. Определить эффективность комбинированной терапии ККГЛ с использованием противовирусного препарата (рибавирин).

8. Разработать рекомендации по диагностическому объему обследования больных ККГЛ и определить направления оптимизации терапии больных ККГЛ.

Впервые определена вирусная нагрузка в крови больных ККГЛ в различные периоды развития заболевания, её динамика в зависимости от наличия/отсутствия противовирусного препарата (рибавирина) в схеме терапии.

Впервые показана диагностическая значимость метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для установления продолжительности периода виремии, определено значение специфических 1§М- и антител в качестве маркеров инфекционного процесса, периода реконвалес-ценции и противовирусного иммунитета.

Впервые показано развитие феномена сероконверсии в сопоставлении с клиническими данными и видом проводимой терапии.

Впервые показана супрессия ответа В-клеток, имеющая наибольшую выраженность при развитии тяжелого течения ККГЛ и в случае развития фатального исхода заболевания.

Впервые установлена роль провоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-2, ГКСФ, ФНО-а) и противовоспалительного (1Ь-4) цитокинов в формировании системного воспалительного ответа при различных вариантах течения ККГЛ, определена динамика изменений профиля изучаемых цитокинов в зависимости от вида проводимой терапии.

Впервые установлена взаимосвязь между поражением клеток-, органов- мишеней и высоким уровнем циркуляции вирусов ККГЛ в крови в различные периоды заболевания, определена зависимость восстановления го-

меостаза форменных элементов крови от вида терапии.

Впервые показано развитие нарушений сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза, клинические и лабораторные признаки дисфункции эндотелия в различные периоды инфекционного процесса.

Впервые показана связь между прогрессирующей дисфункцией органов-мишеней с развитием ДВС-синдрома, тяжелого поражения лёгких по типу острого респираторного дистресс-синдрома и фатальным исходом заболевания.

Впервые установлены предикторы фатального исхода заболевания на основе одновариантного и многовариантного анализа независимых и сопряженных факторов риска.

Впервые доказано снижение смертности пациентов, уменьшение пропорции больных с тяжелыми формами, предикторами фатального исхода инфекции, сокращение продолжительности основных периодов заболевания и пребывания больных в стационаре при применении эффективной противовирусной терапии (рибавирина) в ранние сроки от начала заболевания.

Определение вирусной нагрузки необходимо для диагностики инфекции на ранних стадиях развития ККГЛ, установления продолжительности периода виремии и оценки эффективности противовирусной терапии. Определение специфических противовирусных антител позволяет верифицировать текущую инфекцию ККГЛ и её особенности. Обнаружение высокой вирусной нагрузки с одновременным отсутствием антител классов и/или у больных в предгеморрагическом периоде позволяет прогнозировать последующее развитие тяжелой формы ККГЛ.

Проведение мониторинга состояния сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза и определения маркеров ДВС-синдрома с первых дней клинических проявлений ККГЛ позволяет выявить ранние проявления дисфункции эндотелия и нарушения свертывающей системы крови с целью их своевременной лечебной коррекции в дебюте заболевания.

Выявление факторов риска и предикторов неблагоприятного исхода заболевания позволяет оценить тяжесть течения ККГЛ, прогноз исхода заболевания, определяет необходимость интенсификации терапии, целью которой является борьба за сохранение жизни пациента.

Применение рибавирина в ранние сроки от начала заболевания позволяет оптимизировать терапию ККГЛ, что способствует снижению показателей смертности, уменьшению пропорции больных с тяжелыми формами и предикторами фатального исхода инфекции, снижению количества больных с геморрагиями, сокращению продолжительности основных периодов заболевания и пребывания больных в стационаре.

Адекватное проведение вспомогательной (заместительной) терапии (коррекция объема циркулирующей крови, электролитов, дефицита клеточных компонентов крови и плазменных факторов свёртывания) позволяет ку-

пировать проявления ДВС-синдрома и является необходимым дополнением к противовирусному лечению.

Использование разработанной и внедренной в лечебно-профилактические учреждения лабораторно-диагностической программы позволяет стандартизировать объем исследований. Ежедневный мониторинг показателей периферической крови, гемостаза и важнейших биохимических параметров функций жизненно важных органов и систем позволяет определить объём терапии, направленной на предупреждение критических состояний, индивидуализировать терапию и способствовать купированию проявлений заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

1 .Развитие ККГЛ ассоциировано с высоким уровнем вирусной нагрузки (количеством циркулирующих РНК-содержащих вирусов), отмечающейся с первых дней от начала клинических проявлений заболевания. Циркуляция вирусов ККГЛ является маркером текущей инфекции (РНК+, ^в-),

продолжительность периода виремии (элиминация вируса) верифицируется ОТ-ПЦР.

2.Элиминация вирусов - снижение вирусной нагрузки (феномен серо-конверсии) происходит вследствие взаимодействия с противовирусными антителами. Элиминация вирусов, развитие или отсутствие сероконверсии без назначения противовирусной терапии зависят от выраженности супрессии иммунного ответа, определяют тяжесть течения и исход заболевания. Назначение рибавирина сопровождается увеличением частоты обнаружения специфических антител против вируса ККГЛ, снижением вирусной нагрузки, развитием феномена сероконверсии (РНК-, 1§М+, Период конвалес-

ценции и формирование иммунитета у выздоровевших характеризуется устойчивым титром 1§С-антител (РНК-, 1§М- 1§С+).

3.ККГЛ характеризуется последовательной сменой стадий инфекционного процесса, продолжительность которых определяется совокупностью факторов: путем заражения, элиминацией вируса, развитием и выраженностью ДВС-синдрома и кровотечений, осложнениями, назначением/отсутствием противовирусной терапии.

4.Клиническая картина, выраженность лабораторных сдвигов показателей крови, состояния гемостаза связана с развитием синдрома системного воспалительного ответа, направленного на элиминацию вируса, характеризующегося высоким уровнем циркуляции провоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-2, ГКСФ, ФНО-а) и противовоспалительного (ИЛ-4) цитокинов. Элиминация вируса при проведении противовирусной терапии или вследствие активации иммунной системы обусловливает снижение показателей в крови ИЛ-1 р, ИЛ-6, ИЛ-2, ФНО-а, ГКСФ.

5.В предгеморрагическом периоде наблюдается стремительное поражение клеток-, и органов-мишеней для вируса ККГЛ или ассоциированных с ним иммунопатологических реакций. В дебюте заболевания выраженность

цитопении ассоциируется с высокой вирусной нагрузкой; проявления наиболее демонстративны у больных с тяжелым течением и фатальным исходом заболевания.

6.Тяжесть проявлений заболевания в предгеморрагическом периоде обусловлена развитием нарушений гемостаза, ранними маркерами которых являются дисфункция тромбоцитов и эндотелия (нарушение продукции фактора Виллебранда). Нарушения гемостаза наиболее демонстративны у больных с тяжелым течением ККГЛ, проявляясь I и II фазами ДВС-синдрома.

7.Кратковременная гиперкоагуляция (I фаза) сопровождается укорочением АЧТВ, гиперагрегацией тромбоцитов при снижении их количества и нормальной концентрации фибриногена; гипо- и гиперкоагуляционные сдвиги (II фаза) - прогрессирующей тромбоцитопенией потребления и снижением агрегации тромбоцитов, значительным удлинением ВСК, АЧТВ, ПВ, существенным снижением концентрации фибриногена, ранним и значительным увеличением концентрации РФМК. Развитие гипокоагуляции (III фаза ДВС-синдрома) проявляется критическим снижением количества эритроцитов и гемоглобина, выраженной тромбоцитопенией и тромбоцитопатией, удлинением АЧТВ, ПВ, гипо- и афибриногенемией, высоким содержанием РФМК.

8.Геморрагический период ККГЛ характеризуется развитием III фазы ДВС-синдрома, сопровождается гиперпродукцией провоспалительных цито-кинов ИЛ-lß, ИЛ-6, ФНО-а, ГКСФ, ИЛ-2 и противовоспалительного - ИЛ-4, клиническими признаками геморрагии, профузных кровотечений из различных органов, геморрагического шока, прогрессирующими нарушениями структуры и функции органов-мишеней, полиорганной недостаточностью.

9.Фатальный исход ККГЛ наиболее вероятен при наличии у больного сочетания факторов риска: развитие геморрагических проявлений на < 4 день от начала клинических проявлений заболевания, внутренние кровотечения, повышение уровня АЛТ > 2N, снижение ПТИ < 67 %, удлинение АЧТВ > 113,5 с и снижение количества Тр < 55-109/л). Структура полиорганной недостаточности представлена ДВС-синдромом (100%), печеночной недостаточностью (81,6%), дисфункцией ЦНС (36,8%) и ОРДС (17,9%).

10. Противовирусная терапия рибавирином наиболее эффективна в случае назначения препарата в ранние сроки до развития геморрагического периода. Критериями эффективности терапии является снижение смертности, уменьшение пропорции больных с тяжелым течением ККГЛ предикторами фатального исхода инфекции, уменьшение частоты развития внутренних кровотечений и геморрагий и сокращение продолжительности основных периодов заболевания и пребывания больных в стационаре.

На основе результатов исследования разработана и внедрена в практику программа диагностических и лечебных мероприятий при ККГЛ и ВГЛ неуточнённой этиологии, используемая во всех лечебных учреждениях Ставропольского края врачами инфекционной службы и других специальностей.

Разработана и внедрена программа лабораторных исследований при ККГЛ, предназначенная для врачей клинических лабораторий всех лечебных учреждений Ставропольского края.

Для осуществления практической деятельности специалистов санитарно-эпидемиологических и лечебно-профилактических учреждений здравоохранения, принимающих участие в проведении санитарно-противоэпидеми-ческих (профилактических) мероприятий в отношении ККГЛ на территории ЮФО, изданы Методические рекомендации Министерства здравоохранения РФ (М., 2001 г.) «Организация и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России».

Для осуществления практической деятельности по диагностике и лечению ККГЛ разработаны и внедрены рекомендации Министерства здравоохранения Ставропольского края и Ставропольской государственной медицинской академии «Геморрагический синдром в клинике инфекционных болезней: диагностика и лечение» (2001 г.), «Тактика ведения и лечения больных Крымской-Конго геморрагической лихорадкой» (2003 г.), «Крымская-Конго геморрагическая лихорадка: организация медицинской помощи. Предупреждение и коррекция критических состояний» (2008 г.).

Материалы диссертации используются в преподавании курса (лекции, практические занятия) инфекционных болезней и лабораторной диагностики студентам 5-6-х курсов, в обучении врачей на циклах усовершенствования факультета последипломного образования Ставропольской государственной медицинской академии по специальностям: «инфекционные болезни», «лабораторное дело», «анестезиология и реанимация».

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VI Российском съезде инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003 г.), научно-практической конференции врачей-инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии Юга России» (Адлер, 2003 г.); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004 г.), научно-практической конференции врачей инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии Юга России» (Геленджик, 2004 г.), научно-практической конференции врачей акушеров-гинекологов Ставропольского края «Кровотечения, тромбозы, ДВС-синдром в акушерстве и гинекологии» (Кисловодск, 2004 г.), 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г.), XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005 г.), научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006 г.), VII Российском съезде инфекционистов (Нижний Новгород, 2006 г.), научно-практических конференциях врачей-инфекционистов Ставропольского края (2001-2008 гг.), научно-практических конференциях специалистов по лабораторной диагностике Ставропольского края (2002-2008 гг.); научно-практической конференции

«Эпидемиологический надзор за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2002 г.; 2007 г.), научно-практической конференции с международным участием «Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия» (Санкт-Петербург, 2007 г.), III Южно-Российской научно-практической конференции с международным участием (Сочи, 2008 г.).

По материалам диссертации опубликовано 47 работ, из них 14 в рекомендуемых ВАК изданиях.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, включающего 467 источников, из них 67 отечественных и 400 иностранных автора. Текст диссертации изложен на 356 страницах, содержит 33 таблицы и 104 рисунка.

Материалы и методы исследования. В исследование вошли 426 больных ККГЛ, находившихся на лечении в инфекционных стационарах лечебно-профилактических учреждений Ставропольского края в период 19992008 гг. с подтвержденным диагнозом ККГЛ. Диагностика заболевания основывалась на эпидемиологических критериях, клинических данных и результатах лабораторных исследований, включавших в себя определение специфических противовирусных антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) и обнаружение РНК вируса ККГЛ методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ - ПЦР). Абсолютное большинство больных ККГЛ проживали в сельской местности (99,3%), и только 0,7% (3 пациента) - в городах. Среди пациентов преобладали мужчины - 273 пациента (64,1%), женщины составляли 35,9% (153 человека) (р<0,0001). Средний возраст больных ККГЛ составил 40,89±0,69 лет. Возраст мужчин и женщин был практически равным, соответственно 40,01±0,89 и 41,88±1,1 лет (р>0,05). Основную когорту пациентов - 351 человек (82,4%) составили больные ККГЛ трудоспособного возраста (20-59 лет).

Заболеваемость ККГЛ обусловлена не только проживанием, но и профессиональной занятостью населения в сфере сельскохозяйственного производства в эндемичных районах Ставропольского края (37,3%; п=159 человек) или наличием домашних животных в личной собственности (41,3%; п=176 человек). Внутрибольничное инфицирование ККГЛ зарегистрировано у 8 (1,9%) медицинских работников.

Ведущим механизмом передачи человеку возбудителя ККГЛ является инокуляционный (укус клеща), установленный у 236 (55,4%) больных, у 163 пациентов (38,3%) предполагался вероятный укус клещом вследствие пребывания на природе, ухода за домашними животными, выполнения полевых работ, или контаминационный путь инфицирования при раздавливании кле-

щей незащищенными руками во время снятия их с сельскохозяйственных животных. Гемоконтактный путь заражения при забое животных и разделывании туш был отмечен у 9 (2,1%) больных ККГЛ, не установлен путь инфицирования только у 2,3% больных.

Характерным признаком ККГЛ является сезонная заболеваемость с подъемом заболеваемости в апреле (8,7% заболевших ККГЛ), пиком - в мае-июне (74,4% заболевших ККГЛ), с последующим спадом заболеваемости в июле-августе.

Для характеристики особенностей клинического течения и тяжести течения ККГЛ использовали клинические критерии в соответствии с классификацией, предложенной Е.В. Лещинской [Лещинская Е.В., 1967]. Для определения градаций тяжести использовали наличие/отсутствие одного или нескольких критериев синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) и наличие/отсутствие геморрагических проявлений, их вида и выраженности. Диагностика ССВО основывалась на наличии у пациентов как минимум двух из четырех клинических параметров, включающих: а) гипертермию или гипотермию (>38°С или <36°С); б) тахикардию (>90/мин); тахипноэ (>20/мин) или гипервентиляцию со снижением артериального С02 (РаС02 до 32 ммрт. ст.); в) лейкоцитоз или лейкопению (>12 ООО/мм3 или <4 ООО/мм3 или >10% ювенильных нейтрофильных лейкоцитов) [American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference, 1992]. К тяжелым геморрагическим проявлениям относили кровотечения из слизистых оболочек и внутренних органов с кровопотерей в объеме 1 л и более с развитием геморрагического шока (ГШ).

При составлении программы лечения больных ККГЛ учитывали период заболевания (предгеморрагический, геморрагический, реконвалесценции), выраженность геморрагических проявлений, развитие осложнений, возраст и сопутствующую патологию пациента. В качестве противовирусной терапии использовали рибавирин в соответствии с рекомендациями ВОЗ [2001] и Центра по контролю и предупреждению заболеваний в CUIA(CDC) [1995]. Рибавирин назначали всем больным при наличии эпидемиологических, клинических и лабораторных критериев предполагаемой ККГЛ до постановки диагностических тестов (ИФА, ОТ-ПЦР) с сывороткой крови. В лечении в большинстве случаев использовали рибавирин для перорального приема в форме капсул и у части больных в особых ситуациях (кровавая рвота, про-фузное кровотечение и др.) - для парентерального введения. Ударная доза рибавирина в капсулах составляла 2000 мг однократно (10 капсул), что соответствовало 30 мг/кг веса (при среднем весе больного 70 кг). Поддерживающая доза составляла 1200 мг в два приема (если вес больного более 75 кг) или 1000 мг в 2 приема (если вес больного менее 75 кг) за сутки с интервалом 12 часов. Критериями отмены рибавирина являлись купирование лихорадки и геморрагических проявлений, возврат к нормальным значениям основных показателей периферической крови и свертывающей системы крови. При

назначении рибавирина учитывали противопоказания, установленные для препарата. В дополнение к назначению рибавирина проводили коррекцию нарушений гемостаза, объема циркулирующей крови (ОЦК), водно-солевого баланса (ВСБ), восполнение дефицита факторов свертывания и компонентов крови проведением трансфузии свежезамороженной плазмы (СЗП), тромбо-цитарного концентрата (ТК), эритроцитарной массы (ЭМ), криопреципитата (КП). Объём и направленность инфузионно-трансфузионной терапии определяли на основе ежедневного мониторинга показателей периферической крови, состояния гемостаза, основных биохимических тестов. У части больных в период 1999-2002 гг. противовирусная терапия не проводилась в связи с отсутствием рибавирина на фармакологическом рынке Российской Федерации на тот период времени, а также по причине его отсутствия в рекомендациях по лечению ККГЛ, изданных в 70-х годах, и до настоящего времени не пересматривавшихся.

Для установления диагноза ККГЛ использовали общепринятые клинические и лабораторные методы исследования с определением показателей периферической крови, состояния свертывающей системы крови и основных рутинных биохимических тестов. По показаниям проводились инструментальные методы обследования, включающие в себя электрокардиографию, рентгенологическое обследование органов грудной клетки. При наличии патологии различных органов и согласования тактики ведения больных в условиях палат или отделений интенсивной терапии привлекались соответствующие специалисты.

Для установления окончательного диагноза ККГЛ использовали вирусологическое исследование, определение РНК вируса ККГЛ (ОТ-ПЦР) и специфических антител к нему методом ИФА. Диагноз ККГЛ считали подтвержденным при обнаружении 1§М-антител в сыворотке крови в титре не менее 1:800; четырехкратное и более нарастание титров 1§С-антител; 1§М-антител в титре > 1:200 и более и/или ^в-антител в любом титре в соответствии с методическими рекомендациями [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001].

С целью выделения вируса, циркулирующего на территории Ставропольского края, и определения его филогенетической принадлежности в 2000-2001 гг. у больных ККГЛ были получены пробы крови на высоте лихорадки в течение первых суток заболевания, которые были направлены для проведения вирусологических исследований в Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН [Колобухина Л.В с соавт., 2001]. Определение полной нуклеотидной последовательности Б-сегмента трех коллекционных штаммов вируса ККГЛ было проведено в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ [УавЫпа Ь. е1 а1., 2003; Петрова И.Д., 2003].

Исследование сывороток крови больных проводили в ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотреб-

надзора» (2000-2003 гг.) и вирусологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ставропольском крае» (2004-2006 гг.). Для проведения ИФА использовали тест-системы «ВекторКрым-КГЛ-IgM» и «Вектор-Крым-КГЛ-IgG», производства закрытого акционерного общества «Вектор-Бест» (Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Сыворотку крови людей для исследования подготавливали согласно методическим рекомендациям «Организация и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России» [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001]. Анализ осуществляли по общепринятой методике [Ткаченко Е.А. с соавт., 1982]. Для обнаружения вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР использовали две коммерческие диагностические тест-системы: «АмплиСенс-100 Крым-Конго-281» производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» и «ВекторКрым-КГЛ-РНК-ампли-100» производства закрытого акционерного общества «Вектор-Бест» (Новосибирск). Получение образцов крови для определения РНК вируса ККГЛ осуществляли сразу же при поступлении больного с подозрением на ККГЛ до начала проведения противовирусной терапии.

Изучение вирусной нагрузки (ВН) в крови больных ККГЛ изучали с использованием полуколичественного (2002 г.) и количественного (2003 г.) методов исследований. Использовали тест-систему «АмплиСенс ККГЛ-281», разработанную и производимую ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора». ВН исследовали полуколичественным способом после стандартного выделения РНК и реверсии в ПЦР.

Для оценки изменений состояния гемостаза использовали комплекс показателей, отражающих состояние сосудисто-тромбоцитарного или первичного звена, и плазменного или коагуляционного звена гемостаза [Киш-кун А.А., 2007]. Для оценки тромбоцитарного компонента первичного звена гемостаза использовали подсчет количества тромбоцитов (Тц) в крови и определение их агрегации с различными индукторами: аденозиндифосфат (АДФ), коллаген, адреналин, ристоцетин. Количественное определение фактора Виллебранда (ФВ) оценивали по агглютинации стандартизированного препарата Тц под влиянием антибиотика ристоцетина. Состояние плазменного звена гемостаза оценивали рутинными стандартизированными тестами: время свертывания крови по Ли-Уайту (ВСК), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), концентрация фибриногена (Фг) и растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК). Для подготовки проб и проведения лабораторных исследований состояния гемостаза использовались коагуло-агрегометры Солар-2110 и LA230-2 (НПО БИОЛА), гематологический анализатор «Cobas Micros-18», электрофотометры КФК-2МЦ и КФК-3, термостат ТПС, микроскопы (бинокулярный и с цифровой фотокамерой для компьютерной визуализацией изображения), гематологический счетчик, лабораторные клинические центрифуги ОПН-3 и ОПН-8, счетная камера Горяева. Для исследования агрегации Тц,

обработки цифрового фотоизображения использовали ЭВМ с программным обеспечением.

Кровь для исследования биохимических и гемостазиологических показателей получали в объеме 10-20 мл из локтевой вены или подключичного катетера. Пробы крови, полученные от больных и доноров, стабилизировали 3,8% раствором лимоннокислого натрия (цитрат натрия, тринатрий-цитрат, Na3C6H507-5H20) в соотношении 1:9 [Балуда, В.П., 1995; Баркаган, З.С., 1985]. Исследования производили в течение 1 часа после взятия крови. Для исследования показателей гемостаза использовалась плазма двух типов: обедненная и обогащенная Тц. Плазму, обогащенную Тц, получали центрифугированием цитратной крови 5-10 минут при 1000-1500 об/мин (450-500 g). Приготовление обеднённой Тц плазмы проводилось посредством повторного центрифугирования смеси эритроцитов (Эр), полученной после отбора части обогащенной Тц плазмы, в режиме 3000-4500 об/мин (1200-2000 g) в течение 15-20 мин. Полученную плазму для дальнейших исследований отбирали в пластиковые пробирки.

Исследование биохимических показателей, характеризующих функциональное состояние печени и почек (определение уровня мочевины, креа-тинина, общего белка, уровня ACT, AJIT, билирубина), проводилось рутинными унифицированными методами при поступлении больного в стационар, и далее ежедневно (1-3 раза в сутки) в динамике заболевания до выписки из лечебного учреждения.

Дня исследования профиля цитокинов в крови получали образцы крови у больных ККГЛ до и после назначения терапии в динамике развития заболевания. Содержание в сыворотке крови цитокинов фактора некроза опухоли (ФНО-а), интерлейкина-lb (ИЛ-1р), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлей-кина-4 (ИЛ-4), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и гранулоцитарного колониестимули-рующего фактора (ГКСФ) проводилось твердофазным иммуноферментным методом по стандартной методике с использованием тест-систем ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург, в соответствии с инструкцией производителя.

Группу сравнения, сопоставимую по возрасту и полу с больными ККГЛ, в которой исследовались параметры системы гемостаза, показатели периферической крови и контрольные значения цитокинов составили 40 здоровых доноров.

Для оценки выживаемости пациентов проводили построение кривых и их сравнение методом Каплан-Мейера с вычислением поправки Йетса [ГланцС., 1988]. Для прогнозирования вероятного исхода ККГЛ использовали многовариантный анализ взаимосвязи качественных или количественных факторов риска методом логистической регрессии [Dawson В., 2004]. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы Epi Info (версия 3.3.2) [Dean A.G., 1994].

Для оценки достоверности различий качественных показателей ис-

пользовались таблицы сопряженности с расчетом показателей хи-квадрата, отношения шансов (OR) и соответствующие им 95% доверительные интервалы (95% CI), значения р или точного критерия Фишера (при малом количестве наблюдений). Различия сравниваемых показателей признавались статистически значимыми при 95% CI, не включавшем в себя единицу, и величине р<0,05. Расчет вероятности исхода (предикторы) с учетом выявленных факторов риска выполнен в соответствии с формулой 1/1+ехр[-(Ь0+Ь1х1+Ь2х2+ЬЗхЗ)] [Dawson В., 2004].

Учитывая широкий спектр поставленных задач, использованы различные статистические методы в зависимости от типа данных и структуры исследования. Для статистического анализа количественных признаков использовали t-критерий Стьюдента (двусторонний вариант) с уровнем значимости а, равным 0,05, обеспечивающим вероятность ошибки р<0,05, допустимой для проведения медицинских научных исследований. При отсутствии нормального распределения совокупности использовали непараметрические аналоги критерия Стьюдента: критерий Манна-Уитни (при сравнении двух выборок), критерий Уилкоксона (при сравнения наблюдений до и после лечения) и Крускала-Уоллиса (при сравнении нескольких групп) [Гланц С., 1988].

При проведении регрессионного анализа для оценки взаимосвязей между изучаемыми показателями определяли коэффициент корреляции (г). Взаимосвязь между параметрами считалась очень высокой, если коэффициент корреляции (г) лежал в диапазоне 0,9 и выше, тесной при 0,7-0,9, значительной при 0,5-0,7, умеренной при 0,5-0,31. Для определения статистической значимости коэффициента ранговой корреляции Спирмена использовали соответствующие таблицы. При проведении анализа качественных признаков использовали критерий z с поправкой Йейтса (поправка на непрерывность) при сравнении двух выборок и критерий хи-квадрат [Гланц С., 1988].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Циркуляция вируса ККГЛ в крови больных и формирование иммунного и воспалительного ответа на инфекцию у пациентов, получавших вспомогательную (заместительную) терапию. Изоляция вируса и его генотипирование [Yashina L. et al., 2003; Петрова И.Д., 2003] создали предпосылку для дальнейшего исследования, включающего определение ВН в различные периоды заболевания и системного воспалительного ответа на инфекцию. В течение трех дней от начала заболевания в крови лихорадящих больных установлен период высокой ВН, показатели которой составили соответственно 4,74±4,65; 4,39±3,28 и 4,13±3,98 log копий вируса/мл. К 6-му дню от начала заболевания уровень ВН снизился в 2 раза (2,51±2,17 log копий вируса/мл) от исходного уровня. В последующие дни ВН прогрессивно снижалась, и к 9-13-му дню от начала заболевания в крови обнаруживались только единичные копии РЖ вируса. Циркуляция вируса в крови больных и продолжительность виремии были также подтверждены посредством опреде-

ления РНК вируса ККГЛ с помощью ОТ-ПЦР. Наибольшее количество (75,1%) положительных результатов определения РНК вируса ККГЛ с помощью ОТ-ПЦР были получены в течение пяти дней от начала заболевания. На последующем этапе развития инфекции (6-й - 14-й дни) РНК вируса ККГЛ выявлялась только у 44 (24,9%) больных.

Выявленная стабильность популяции вируса в нашем регионе (Южный федеральный округ России) позволяла предположить универсальный стереотипный характер иммунного и воспалительного ответа на инфекцию, в отличие от ситуации, когда в организме больного циркулируют штаммы, различающиеся по своим иммуногенным характеристикам.

Циркуляция РНК вируса ККГЛ в крови больных снижается на фоне нарастания титра специфических антител с 3-го по 6-й дни от начала заболевания в титре 1:200 - 1:400 (у 17,2% больных) с максимально высоким титром (1:800 - 1:3200 и выше) с 6-го дня по 10-й (у 62,3% больных) с постепенным снижением этого показателя (рис.1).

Рис. 1. Частота выявления РНК вируса ККГЛ и ^М- и ^в-антител к нему у больных в различные дни от начала клинических проявлений ККГЛ

Антитела класса М к возбудителю ККГЛ сохранялись в титрах от 1:100 до 1:2500 с 11-го по 43-й дни от начала болезни в 60,6 % случаев. Антитела ^ в период с 6-го по 10-й дни заболевания выявлены только у 20,5% больных с последующим увеличением частоты обнаружения антител этого класса к 14-му дню от начала заболевания. При сравнении трендов частот обнаружения и ^в-антител выявлено, что к 10-му дню от начала заболевания наблюдается отчетливый феномен «перекреста» кривых (снижение ^М- и увеличение частоты 1£0-антител). Полная элиминация вируса ККГЛ отмечается к 14-му дню от начала заболевания. Поскольку больные, у которых определялась ВН, не получали специфической противовирусной терапии, это свидетельствует об элиминации вируса вследствие ответной реакции иммунитета.

К особенностям иммунного ответа следует отнести появление антител класса ^М в титрах 1:800 - 1:12800 у больных с тяжелым течением заболе-

вания (п=21) в более поздние сроки (на 11-13 дни) от начала заболевания, чем у больных со среднетяжелыми формами инфекции (п=41). Антитела класса в в данной группе больных выявлены в титрах 1:200 - 1:6400 только у единичных больных с 9-го дня от начала болезни. Продукция наступала в более поздние сроки, чем у больных средней тяжести течения заболевания (с 9-го дня от начала заболевания). При этом у 17 тяжелых больных ККГЛ РНК вируса выявлена методом ОТ-ПЦР с 1-го по 6-й дни болезни.

При исследования крови методом ОТ-ПЦР у всех умерших больных с 4-го по 9-й дни от начала заболевания выявлена РНК вируса ККГЛ или антиген вируса при исследовании трупного материал (в одном случае). Только у двух пациентов определены на 4-е и 7-е сутки от начала заболевания и РНК вируса ККГЛ. В течение 2-3 лет в сыворотке крови пациентов после перенесенной инфекции сохраняются ["О-антитела в достаточно высоких концентрациях. Только у трех субъектов, перенесших инфекцию ККГЛ, в эти сроки произошло исчезновение 1§С-антител.

Анализ полученных данных позволяет определить диагностическую значимость определения РНК, специфических 1§0- и 1§М-антител на разных стадиях заболевания (рис. 2). Установлено, что выявление РНК вируса ККГЛ имеет наибольшее диагностическое значение в течение первых пяти дней от начала заболевания, а выявление специфических антител класса и класса может служить подтверждением диагноза ККГЛ в более поздние сроки.

Рис. 2. Частота обнаружения РНК вируса ККГЛ и специфических антител классов ^М и в различные сроки от начала клинических проявлений ККГЛ

Полученные нами данные о циркуляции вируса ККГЛ в крови в различные периоды развития инфекции соответствуют немногочисленным результатам исследования виремии, проведенным во время недавних вспышек этой инфекции в Турции и Косово [Е^опи1 О., 2008; ЭиЬ О. й а. 2007].

Элиминация вируса вследствие иммунного ответа на инфекцию поддерживается развивающимся воспалением, характеристикой которого является продукция воспалительных медиаторов. В течение основных периодов ККГЛ в крови больных независимо от степени тяжести отмечается высокий уровень

продукции цитокинов - ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-2, ГКСФ, ФНО-а и противовоспалительного - ИЛ-4, показатели которых статистически значимо (р1.5<0,05) превышали значения в группе практически здоровых лиц. Выявлены индивидуальные колебания уровней циркулирующих противоспалительных цитокинов с максимальными и минимальными пиками концентраций. В течение всех фаз развития инфекционного процесса при ККГЛ отмечалась высокая продукция ИЛ-1(3, рассматриваемая нами как ответная воспалительная реакция организма человека на инфицирование вирусом ККГЛ. Повышение концентрации циркулирующего ИЛ-1(3 отмечалось в виде двух пиков на 3-й (224,63±74,15 пг/мл) и 7-й дни (172,56±89,74 пг/мл) от начала болезни (р1-2<0,05 в сравнении с нормой). Наибольший пик концентрации ФНО-а отмечался на 6-й день (60,1±24,50 пг/мл) от начала заболевания с постепенным снижением циркуляции этого фактора к 9-му дню. В динамике развития болезни статистически значимые колебания концентрации ГКСФ, ИЛ-2 и ИЛ-6 в крови больных ККГЛ отсутствовали. Высокая концентрация ИЛ-4, циркулирующего в крови во время всего периода клинических проявлений заболевания, свидетельствовала об участии формировании ответа организма на инфекцию ККГЛ не только, про-, но и противовоспалительных цитокинов. Наиболее высокая концентрация ИЛ-4 была выявлена на 5-е и 6-е сутки от начала заболевания - соответственно 79,46±24,96 и 96,84±22,78 пг/мл (р<0,05 в сравнении с нормой). В группе больных тяжелым течением ККГЛ уровни циркулирующих в крови цитокинов ИЛ-1(3 и ИЛ-6 (р<0,05) были более высокими, чем в группе больных средней степени тяжести, а у больных с ГС концентрация ИЛ-10 и ФНО-а выше (р<0,05) в сравнении с группой больных без геморрагий (табл. 1).

Концентрация цитокинов в крови больных ККГЛ с различными

клиническими вариантами течения и тяжести

Здоровые доноры Группы больных

Цигокины с ГС без ГС тяжелые средней тяжести

шыр 20,4±6,2 208,8±32,4*л 71,7±11,3* 201,8±26,8*Л 97,4±16,0*

пг/мл п=15 п=17 п=19 п=29 п=50

ИЛ-б 8,4±1,6 136,7±21,8* 100,7±10,8* 173,8±25,8*л 102,2±8,3*

пг/мл п=15 п=22 п=15 п=18 п=26

ФНО-а 8,5±1,6 43,1±6,8*л 32,9±5,7* 38,9±4,6* 37,1±6,6*

пг/мл п=15 п=43 п=27 п=23 п=48

ИЛ-4 6,01± 1,06 98,4±30,7* 74,7±16,7* 102,5±32,8* 81,3±18,4*

пг/мл п=12 п=14 п=18 п=8 п=11

ИЛ-2 7,5±1,1 687,7±79,0* 594,2±93,8* 748,7±69,4* 593,2±72,3*

пг/мл п=12 п=17 п=16 п=23 п=24

ГКСФ 0,3±0,05 8,17±0,71* 7,68±0,47* 6,75±0,32* 8,38 ±0,54*

нг/мл п=15 п=28 п=38 п=46 п=20

ГС - геморрагический синдром; * - р<0,05 в сравнении с нормальными значениями; л - р<0,05 в сравнении показателей в изучаемых группах, различающихся по тяжести и наличию ГС.

Особенности поражения клеток-мишеней, органов и тканей при ККГЛ в начальном или предгеморрагическом периоде заболевания при проведении вспомогательной терапии. Известно, что основными клетками-мишенями для вируса ККГЛ, являются мононуклеарные фагоциты, эндо-телиальные клетки и гепатоциты [Burt F.J. et al., 1997], поражение которых во многом определяет формирование клинических и лабораторных проявлений заболевания. В первые дни заболевания характерным является развитие феномена цитопении, свойственного лейкоцитам (Л), лимфоцитам (Лц), Тц и Эр. Снижение количества указанных показателей отмечается уже со 2-3-х суток от начала клинических проявлений с последующим прогрессирующим снижением на 5-7-е сутки. Наиболее низкие значения Л отмечались на 5-е сутки от начала заболевания - 2,42±0,33-109/л при уровне ВН 3,0б±0,54 log копий/мл. Выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость между уровнем ВН и количеством Лц с 6-х суток от начала заболевания (г = - 0,575; р<0,05). Высокий уровень ВН в крови больных ККГЛ в первые два дня сопровождается развитием двух вариантов реакции белой крови на инфекцию: ней-тропении и нейтрофильного лейкоцитоза со сдвигом влево вплоть до появления юных, незрелых форм Л. Ранняя лейкопения отражает или высокий уровень деструкции этих клеток на периферии, или супрессию белого ростка кроветворения, развивающиеся как следствие интенсивной виремии. Возможно, снижение количества нейтрофилов во время выраженной виремии может быть связано с фиксацией вируса ККГЛ на мембране Л с помощью специфических трансмембранных гликопротеинов [MaruyamaT. etal., 1998]. Возможными причинами лимфопении при ККГЛ является поражение клеток, продуцирующих Лц, и органов, содержащих лимфоидную ткань [Baskerville A. et al., 1981]. Стремительное снижение количества Лц и других родственных клеток, вероятно, является следствием неконтролируемой репликации вирусов, характеризующейся выраженной ВН и как следствие - апоптоз или дисфункция дендритных клеток [Geisbert T.W. et al., 2003; Hensley L.E. et al., 2002; Baize S. et al., 2004] . Предполагается, что снижение регуляторной роли дендритных клеток в иммунном ответе, установленное при других ВГЛ, является также ведущей причиной формированиия иммуносупрессии и при ККГЛ.

Снижение количества Эр наблюдали со 2-х суток от начала заболевания -3,78±0,11-10,2/л (р<0,001в сравнении с группой здоровых доноров). У всех больных с тяжелым течением ККГЛ наблюдались изменения морфологии Эр - ани-зоцитоз, пойкилоцитоз, а также обнаруживались эритробласты. Относительная стабилизация уровня Эр, но сохранение их дефицита по отношению к норме происходило по мере снижения циркуляции вируса. Предположительно, уменьшение количества Эр связано с реакцией хозяина на вирусную инфекцию, проявляющуюся активацией фагоцитов и деструкцией Эр, экспрессирующих на своей поверхности сигнальные молекулы (непрямые маркеры вирусной инфекции) [Karti S.S. et al., 2004; Fisgin N. et al, 2008; Duh D. et al., 2007].

Тромбоцитопения является постоянным признаком инфекции ККГЛ. Количество Тц уже на 3-й сутки у 47 больных было до 173,05±8,38-109/л (р<0,05 в

сравнении с нормой), хотя средние величины оставались в пределах референтных значений. В группе умерших больных колебания количества Тц в динамике заболевания отмечались от 5 до 290-109/л (мода 60). На 4-е сутки от начала заболевания в группе умерших больных количество Тц (97,79±5,56Т09/л) было ниже (р<0,05) в сравнении с группой выживших больных.

Предполагают, что одной из причин развития цитопении у больных ККГЛ может быть гемофагоцитоз, впервые описанный у больных ККГЛ Кагй Б.Б. е1 а1. [2004]. Вторичный или «вирусассоциированный гемофагоцитарный синдром» обусловлен системным воздействием вирусов и избыточной продукцией гиперактивированных лимфоцитов (Т1-хелперами) и макрофагов разнообразных цитокинов, определяющих клиническую манифестацию -лихорадку, гепатоспленомегалию, цитопению, дисфункцию печени и коагу-лопатию [ЬаггосЬе С., Моийюп Ь., 2004].

Обнаруженные нами нарушения тромбоцитопоэза при ККГЛ, вероятно, являются следствием патологических процессов в костном мозге, связанных или с инфицированием вирусом клеток-предшественников, или с нарушением их созревания [8\уаперое1 Я. е1 а1., 1989; А1-ТйсгШ 8.К. е1 а1., 1981].

Нами установлено, что у больных ККГЛ имеется нарушение морфологии (гигантские Тц и мегакариоциты) и значительное снижение агрегацион-ной способности Тц. При исследовании Тц агрегация с ристоцетином, АДФ и адреналином (п=40) уже на 2-3-и сутки угнетена в среднем до 20%. Нами убедительно доказано, что значительное нарушение функциональных свойств Тц, регистрируемое как снижение агрегации, не является следствием уменьшения их числа, так как во всех исследованиях проводилась корректировка бедной Тц плазмы для стандартизации регистрации агрегационных кривых. Механизм агрегации Тц под влиянием антибиотика ристоцетина существенно отличается от других индукторов фактора, так как ристоцетин обеспечивает агрегацию путем ассоциации с гликопротеином 1Ь тромбоци-тарной мембраны, активируя эту молекулу для связывания ФВ. Снижение агрегации Тц при стимуляции ристоцетином продолжалось вплоть до пятых суток, когда этот показатель снижался до 19%, а в ряде случаев - до полного отсутствия. Снижение содержание ФВ в плазме крови при количестве Тц в пределах референтных величин является ранним признаком эндотелиального повреждения (дефицита синтеза ристоцетином ФВ), что позволяет использовать данный метод как прогностический в развитии возможных геморрагических проявлений. Таким образом, уже в первые сутки заболевания до развития геморрагий имеет место развитие гемокоагуляционных нарушений: в первую очередь, со стороны первичного или сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза, в виде нарушения морфофункциональных свойств Тц с последующим снижением их количества. Клинически данные нарушения и поражения сосудистого эндотелия проявлялись у 92,4% больных в виде полнокровия, инъецированности склеральных и конъюнктивальных сосудов. Признаки поражения эндотелия сосудов лёгких выражались развитием интерсти-циального отёка и отёка плевральных оболочек (у 5,7 и 2,85% больных соот-

ветственно). Наиболее манифестным были формирование постинъекционных гематом, положительные пробы щипка (у 17,2 и 26,1% больных соответственно). К косвенным маркерам поражения сосудов почек можно отнести про-теинурию, выявленную в общем анализе мочи при обследовании больных средней степени тяжести (24,4%) и тяжелым течением (15,3%) ККГЛ. В предгеморрагический период у больных происходило увеличение размеров печени без повышения уровня маркеров цитолиза гепатоцитов (АЛТ и ACT).

Таким образом, основными клетками-мишенями для вируса ККГЛ являются эндотелиалъные клетки, мононуклеарные фагоциты и, возможно, дендритные клетки [Bray М., 2007], участвующие в фагоцитозе и иммунном ответе, а также гепатоциты. Прямое цитопатическое действие вируса ККГЛ и вторичное развитие иммунных воспалительных реакций при высокой персистирую-щей циркуляции в крови провоспалительных цитокинов являются взаимосвязанным процессом, обусловливающим развитие болезни, ССВО и клинические проявления заболевания на ранних этапах развития инфекции ККГЛ.

Геморрагический синдром и нарушение гемостаза у больных ККГЛ, получавших вспомогательную (заместительную) терапию. ГС является клинической «визитной карточкой» ККГЛ и характеризуется развитием геморрагий различной степени выраженности и продолжительности и соответствующей кровопотери, определяющих тяжесть и прогноз исхода заболевания. Ранним и характерным проявлением ГС у всех больных ККГЛ является геморрагическая сыпь в виде петехий (85,6%) преимущественно в области нижних конечностей (голени, бедра), аксиллярных областях, в местах контакта с тесно прилегающей одеждой, реже в области передней брюшной стенки. Наиболее частыми в структуре внутренних кровотечений являются желудочно-кишечные (18,9%) и маточные кровотечения (16,7%). Значительно реже диагностировали кровоизлияния в головной мозг и субарах-ноидальные кровоизлияния (6,8%), легочные кровотечения (3,8%) и кровотечения в плевральную полость (2,3%). Острую кровопотерю с развитием ГШ наблюдали у семи (5,3%) больных ККГЛ. Среднетяжелое течение ККГЛ характеризуется геморрагическими проявлениями в различных сочетаниях без значительной кровопотери.

С развитием ГС тромбоцитопения прогрессирует, являясь одним из клеточных маркеров ДВС-синдрома и показателем тяжести состояния больных (рис.3). Минимальные значения количества Тр до 96,11±5,56-109/л наблюдали на 7-9-е сутки заболевания. У 48,9% больных уровень Тц был менее 50-109/л, в ряде случаев достигая 7-15-1 09/л. Прогрессия тромбоцитопении в последующие временные отрезки при развитии инфекции ККГЛ, очевидно, связана с увеличением их потребления во время развития гемокоагуляцион-ных сдвигов [Chen J.P., Cosgriff Т.М., 2000].

1 23456789 10 Дни болезни

Рис. 3. Динамика уровня тромбоцитов у больных ККГЛ, получавших различную терапию (* - р<0,05 в сравнении с началом заболевания; * - р<0,05 в сравнении с группой больных, получавших заместительную терапию)

С 9-го дня от начала заболевания количество Тц начинает повышаться, совпадая по срокам с окончанием геморрагического периода. Наиболее низкие цифры агрегации Тц (4-9%) при функциональных пробах с адреналином и ристоцетином отмечены на 5-6-е сутки от начала заболевания, при использовании АДФ - к 7-м суткам.

Ранняя диагностика ДВС-синдрома у больных ККГЛ инициировалась проведением скрининга с использованием определения ВСК с первых часов поступления больных. Удлинение ВСК и АЧТВ (р<0,05 в сравнении с нормой) начинается с 3-4-х суток от начала заболевания. К 7-му дню от начала заболевания отмечено максимальное удлинение ВСК до 5023,5±402,9 с и АЧТВ до 102,98 ±9,81 с (р<0,05 в сравнении с нормой).

С 3-х суток от начала заболевания установлено снижение концентрации Фг в крови ниже уровня нормальных значений (2,2±0,25 г/л, р<0,05) и высокий уровень РФМК, достоверно (р<0,05) превышающий показатели нормальных значений (6,59±0,24%о). Наиболее низкие значения концентрации Фг наблюдали на 5-6-е сутки от начала заболевания (1,52±0,1 и 1,63±0,1 г/л соответственно). Выявленный в крови больных высокий уровень РФМК с колебаниями в пределах от 4,25±0,25 до 6,76±0,21%о вплоть до 13-х суток заболевания характерен для ДВС-синдрома как маркер тром-бинемии. В мазках крови выявлены признаки фрагментации Эр. Таким образом, выявленные изменения количества Фг, удлинение показателей АЧТВ, ПВ свидетельствуют о развитии коагулопатии потребления (снижении уровня и активности антитромбина III) и являются проявлениями ДВС-синдрома и ассоциированных с ним геморрагий при ВГЛ [McKay D.G., Margaretten W., 1967]. В свою очередь, тяжесть заболевания определяется

выраженностью ДВС-снндрома, являющегося причиной развития геморра-гий [Cosgriff Т.М., 1989]. Снижение уровня факторов коагуляции и увеличение циркуляции в крови продуктов деградации фибрина как стигмы ДВС-синдрома при ККГЛ были выявлены и другими исследователями [Swane-poel R. et al., 1989; Al-Tikriti S.K. et al., 1981].

В период геморрагических проявлений гепатомегалия определялась практически у всех больных (96,2%). Изменения биохимических тестов (уровни билирубина, ACT и АЛТ) наиболее демонстративны для больных тяжелым течением ККГЛ. Уровень билирубина в среднем составлял 27,26±2,93 мкмоль/л (р<0,05 при сравнении с нормой), а уровни АЛТ и ACT в 2 -3 раза превышали нормальные значения (р<0,05). К признакам поражения печени относили также снижение концентрации Фг и увеличение ПВ с максимальными значениями в крови до 22,1 ±1,08 с на 6-е сутки заболевания. Поражение гепатоцитов вирусом ККГЛ [Burt F.J. et al., 1997] с развитием дисфункции и нарушением синтеза факторов коагуляции обеспечивает про-грессирование ДВС-синдрома.

У больных ККГЛ с диагностированным ДВС-синдромом с маточными, носовыми кровотечениями, имевшими профузный характер, наблюдали наиболее тяжелые поражения легких. Выявленные поражения легких (п=26) удовлетворяли критериям острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) и ассоциировалось с развитием отека, плеврального выпота, легочно-сердечной недостаточности, у части больных - с кровохарканьем, легочными и внутриполостны-ми (в полость плевры) кровотечениями [Soubani А.О, Pieroni R., 1999].

Появление геморрагий, ДВС-синдрома и поражение органов-мишеней сопровождалось гиперпродукцией провоспалительных цитокинов: ИЛ-ip (279,85±122,46 пг/мл), ИЛ-6 (136,71±21,81 пг/мл), ФНО-а (43,19±б,86 пг/мл), ГКСФ (8,17±0,71 нг/мл), ИЛ-2 (687,7±79,0 пг/мл) и противовоспалительного - ИЛ-4 (98,43±30,73 пг/мл) (pi.6<0,05 в сравнении с нормой). Особый интерес представлял анализ данных концентрации цитокинов ИЛ-1р.и ФНО-а в крови больных ККГЛ с диагностированными клиническими проявлениями ГС и без них (табл. 1).

Известно, что повреждение эндотелия развивается вследствие атаки циркулирующих в крови цитокинов, в особенности ИЛ-1 и ФНО-а [Pober J.S., Cotran R.S., 1990], имеющих множественные эффекты воздействия на эндотелиальные клетки, включающие супрессию антикоагулянтной активности их поверхности и увеличение - прокоагулянтной [Bevilacqua М.Р. et al., 1984]. Последствием этого иммунологического сдвига является активация коагуляционного каскада. У больных ККГЛ с критическими показателями ДВС-синдрома в фатальных случаях обнаружена положительная корреляция между высокими уровнями ИЛ-6 и ФНО-а и, а также - отрицательная с уровнем ИЛ-10 [Ergonul О. et al., 2006].

Таким образом, патогенетические механизмы геморрагических про-яв-лений при ККГЛ представляют собой прямое воздействие на клеточные

. функции, прежде всего эндотелиальных клеток, тромбоцитов, гепатоцитов, мононуклеарных клеток и влияние посредством активации иммунного и воспалительного путей на регуляцию гемостаза и целостность сосудов. Поражение эндотелия вирусом ККГЛ или вирус-опосредованными факторами хозяина вызывают его активацию и дисфункцию, а изменения количества и морфофункциональных свойств Тц являются ключевыми событиями в активации внутреннего каскада свертывания и ДВС-синдрома [Schnittler H.J., Feldmann H., 2003]. В свою очередь, поражение печени усугубляет и обеспечивает прогрессирование ДВС-синдрома. Вовлечение в патологический процесс печени, легких и почек является критическим событием в течении заболевания, обусловливая развитие ПОН и неблагоприятный исход.

Клинические проявления заболевания в зависимости от стадий инфекционного процесса. При проведении анализа клинического течения ККГЛ в Ставропольском крае у абсолютного большинства обследованных нами больных (81,5%) четко прослеживалась динамика развития заболевания с последовательно развивающимися стадиями: инкубационный, пред-геморрагический, геморрагический и выздоровления. Продолжительность и характер симптомов каждой фазы может варьировать в различных очагах инфекции [Whitehouse С.А., 2004]. В наших исследованиях инкубационный период наблюдали от 1 до 11 суток, в среднем 3,13±0,15 дня. Продолжительность его определялась особенностями путей заражения пациентов. Наиболее короткий (3,27±0,22 дня) установлен при инокуляционном пути заражения, а более продолжительный - (4,23±0,25 дня) - при контаминаци-онном (р<0,05 в сравнении с инокуляционным). Вероятно, существенно меньшее количество вируса, попадающее в кровь, приводит к более продолжительному инкубационному периоду, но его продолжительность не оказывает влияния в последующем на тяжесть течения и развитие геморрагических проявлений у больных ККГЛ. Возможно, это связано с ответной реакцией хозяев вируса, индуцировавших его фенотипические изменения, обусловливающие модуляцию вирулентности [Gonzalez J.P. et al., 1995].

Колебания продолжительности предгеморрагического периода (в среднем 3,61±0,11 дня) в нашем исследовании в целом совпадают с литературными данными [Swanepoel R. et al., 1987; Лазарев В.Н., 1968]. У больных с фатальным исходом ККГЛ предгеморрагический период был более коротким в сравнении с группой выживших больных с тяжелым течением заболевания, составив соответственно 3,47±0,12 и 4,17±0,14 дня (р<0,001). Полагаем, что раннее развитие периода геморрагических проявлений может быть связано с интенсивным развитием ответной реакции организма хозяина в ответ на выраженную ВН. Клинические проявления предгеморрагического периода неспецифичны, отражают общую реакцию организма на репликацию вируса в органах- и клетках-мишенях, и неспецифическую реакцию основных систем в ответ на нарушение гомеостаза (табл. 2). Нами была изучена продолжительность лихорадочной реакции в предгеморрагиче-

ский период в зависимости от степени тяжести течения заболевания. Наиболее длительный период лихорадки установлен у больных с тяжелым течением ККГЛ - до 8,04±0,25 дня, (р<0,05 в сравнении с больными средне-тяжелой и легкой формами). Полагаем, что происхождение лихорадки при ККГЛ ассоциировано с высоким уровнем продукции провоспалительного цитокина TNF-a моноцитами/макрофагами и Т-лимфоцитами [Selby Р. et al., 1987]. Выраженность лихорадки (>39 °С), миалгий, ломоты в теле, ано-рексии, тошноты, тахикардии и тахипное в первые 3-5 дней от начала заболевания в сочетании с полученным профилем цитокинов подтверждает развитие ССВО, что позволяет считать уровень и продолжительность лихорадочной реакции одним из критериев определения степени тяжести (выраженности ССВО) больных ККГЛ [Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis, American College of Chest Physicians /Society of Critical Care Medicine Consensus Conference, 1992].