Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему: Бактерии рода Rhodococcus
Диссертация в виде научного доклада разослана « ^^ » ноября 1997 г.
Ученый секретарь специализированного совета, A.B. Зурочка
ДАПК Диаминопимелмновая кислота
ИМВ Институт микробиологии и вирусологии АН Украины
ИНМИБ Институт микробиологии АН Белоруссии
ИЭГМ Иист1ггут экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
МПА мясопептонный агар
МШ< минимальная подавляющая концентрация антибиотиков
МТБЭ метил-трегичнобутиловый эфир
нМФА непрямой метод флуоресцирующих антител
РА реакция микробной агглютинации
РИ реакции иммунодиффузии в агаровом геле
СЖА сахарозо-желатиновый агар
ПЦР полимеразная цепная реакция
MSDN Международная сеть данных о штаммах микроорганизмов и клеточных линиях (Microbial Strain Data Network)
NCIMB Национальные коллекции промышленных и морских бактерий (National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited)
WDCM Всемирный центр данных о микроорганизмах (World Data Centre for Microorganisms)
WFCC Всемирная федерация коллекций культур (World Federation for Culture Collections)
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Разрушение биологического разнообразия идет катастрофическими темпами. По данным Лондонского фонда международного законодательства об окружающей среде (Sands, 1994), если непрерывные потери видов будут идти с той же скоростью, с какой они идут сейчас, то в последующие 25 лет будет уничтожено 15 % видов на Земле, при этом к 2040 году будут исчезать ежедневно от 20 до 75 биологических видов. В связи с этим одним из важнейших направлений биологических исследований в настоящее время является изучение биологического разнообразия и поиск путей его сохранения (Convention on Biological Diversity, 1992; Global Biodiversity Strategy, 1992).
Возникшая на пороге XXI столетия угроза потери природных ресурсов Земли ставит на первый план задачу гарантированного сохранения генетического пула микроорганизмов и их многообразия для будущих поколений. По оценкам специалистов, прекращение деятельности микроорганизмов означает гибель всей жизни на нашей планете в 4-х дневный срок (Калакуцкий, 1993). Несмотря на глобальную незаменимую роль микроорганизмов в земных экосистемах, до настоящего времени описана лишь малая часть (менее 5%, в частности для эубактсрий около 1% видов) действительного разнообразия микроорганизмов (Bull, Hardman, 1991; Hawksworth, Colwell, 1992; Amann et al., 1995). Один из наиболее эффективных способов сохранения микроорганизмов, особо важных для экоце-нозов и хозяйственной деятельности человека, - их поддержание в микробных коллекциях, имеющих значимость для фундаментальных научных исследований и развертывания новых биотехнологических производств. Грядущее столетие, обещающее быть веком экологически чистых технологий, непременно потребует вовлечения в сферу практического использования все новых групп микроорганизмов. В связи с этим на рубеже XX и XXI вв. во всех странах мира наблюдается интенсивное формирование децентрализованных банков живых культур, период ренессанса коллекционного дела и становления биоинформатики. В нашей стране работа по выполнению Конвенции о биологическом разнообразии в области коллекционного дела и биоинформатики проводится в рамках ГНТП РФ "Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии" по направлению "Коллекции биологических объектов - культур микроорганизмов, клеток человека, животных и растений" и ГНТП РФ "Новейшие методы биоинженерии" по направлению "Биотехнология защиты окружающей среды". Основная цель проектов -формирование децентрализованных отечественных коллекций, отвечающих потребностям пользователей, создание банков жизнеспособных культур и банков данных об этих культурах, которые будут представлять специализированные узлы общей сети взаимодействующих по единым правилам коллекций в стране и за рубежом.
О несомненном возобновлении интереса к деятельности микробных коллекций свидетельствуют меморандум Международных союзов биологических наук и микробиологических обществ "Микробное разнообразие 21" (Microbial Diversity, 1991) и, как следствие его, разработка приоритетной Международной программы "DIVERSITAS" (Haks-worth, Aguirre-Hudson, 1994), в которых обозначено, что сегодня более интенсивно должно вестись изучение микроорганизмов, связанных с деятельностью человека и участвующих в восстановлении затронутых этой деятельностью экосистем; особое внимание должно быть уделено группам микроорганизмов, имеющих функциональное значение для биосферы и экосистем; инвентаризации известных видов и активной ревизии состояния микроорганизмов в природных микробиоценозах; созданию специализированных региональных центров и информационных сетевых сообщений.
Актуальность проблемы. Одной из таких эколого-трофических групп, ведущих окисление природных н антропогенных углеводородов и таким образом участвующих в биогеохимических процессах биосферы, формировании безуглеводородной атмосферы Земли, являются бактерии рода Rliodococciis, принадлежащие к актиномицетно-нокардиоформной линии эволюции прокариот. Обнаружение среди родококков способности аккумулировать молекулярный азот в присутствии н-алканов дает основание предполагать о древнем происхождении углеводородусваивающих азотфиксаторов и их полезной роли в поддержании азотного и углеродного баланса в природе. Они постоянные и доминирующие компоненты естественного биоценоза нефтяных загрязнений, в связи с чем очевидны целесообразность и необходимость использования определенных видов алканотрофных родококков в системе мониторинга углеводородного загрязнения биосферы и для очистки нефтезагрязненнык территорий
Особое место среди алканотрофных родококков занимают представители, биохимическая уникальность которых - способность ассимилировать в качестве единственных источников углеродного питания газообразные углеводороды (пропан, н-бутан). Синтезируемая ими ферментная система обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует реакции биотрансформации практически всех классов органических соединений. В настоящее время реально использование этой группы родококков в качестве бно-катализаторов в тонком органическом синтезе, высокоэффективных биосинтетиков белка на основе углеводородных газов и биологических индикаторов углеводородных залежей. Многие представители родококков имеют важное значение как уникальные источники иммуномодуляторов, биополимеров, витаминов, специфических трансформирующих ферментных систем и агенты химической трансформации (Finnerty, 1992; Warhurst, Fevv-son, 1994). Сегодня алканотрофные родококки - одна из наиболее разрабатываемых групп эубактерий в прокариотологии. Так, если в списках Всемирного патентного индекса (World Patent Index, Derwent Information Ltd., London, UK) число патентов с использованием родококков в производстве акриламида и акриловой кислоты, для получения окиси пропилена и активных форм эпоксидов, представляющих основу для синтетических полимеров, для конверсии гпогенпроизводных углеводородов и фенолов, обладающих канцерогенным свойством, и стероидных соединений в 1990 г. составляло 10, в 1994 -20, то уже в последние три года оно составляет 80. свидетельствует о неуклонном возрастающем интересе к данной группе организмов как объекту промышленного использования и перспективных биотехнологий.
Родококки, обладающие необъятным функциональным разнообразием и характерным комплексом реализуемых стратегических приемов выживания, приобретают все большую экологическую значимость, ибо на фоне современного кризиса состояния окружающей среды увеличивается число местообитаний, в которых организмы находятся в экстремальных условиях. Несмотря на то, что биология алканотрофных родококков в последнее десятилетие находится в центре внимания исследователей, биологическое разнообразие этой практически значимой группы микроорганизмов до сих пор охарактеризовано неполно. Без особого внимания остаются вопросы адаптации родококков к изменяющимся условиям внешней среды, переключения с использования одних источников углерода и энергии на другие.
Среди Rhodococais spp. известиы возбудители инфекционных заболеваний человека, животных и растений. В 1991 г. описано тридцать случаев выявленш R.equi в крови больных СПИД (Emmons et al., 1991; Prescott, 1991). Представители данного вида входят в "Список распределения известных бактерий по степени потенциальной опасности при работе с ними", подготовленный экспертами Европейского экономического общества (Council Directive 93/88/ЕЕС, 1993). В этой связи перспективность родококков для эксплуатации их в условиях открытых систем (почв, вод, очистных сооружений) ставит не-
отложную задачу изучения патогенности R>iodococcus spp. с целью определения уровня риска при интродукции их в природные среды.
Систематика родококков - объект непрерывной оценки. Разрабатываются новые схемы классификации (Головлсв, 1983; Нестеренко и др., 1985), утверждаются новые виды Rhodococcus (Klatte et al., 1994а; Stoecker et al., 1994, Briglia et al, 1996), идет процесс редукции видов в результате перевода видовых названий в категорию синонимов (Klatte et al., 1994; Rayney et al., 1995), а также объединения отдельных видов в новые роды (Collins et al, 1988, Stackebrandt et al, 1988, Rayney el al, 1995a). Выделение новых родов Dietzia, Gordona и Tsukamurella для организмов, ранее считавшихся родококками, делает труднодифференцируемый таксон Rhodococcus более однородным и относительно стабильным. Тем не менее приходится констатировать существенный разрыв между современной таксономией и практической идентификацией данной группы организмов. Общепринятая дифференциация нокардиоформ по совокупности генетических, хемотаксоно-мических и фенотипических признаков длительна, трудоемка, неприемлема в экологических исследованиях и при скрининге практически ценных культур. Число доступных исследователю экспрессных, простых и надежных диагностических тестов невелико. В арсенале исследователя нокардиоформ до настоящего времени не существует достоверного метода, пригодного для массового анализа однородности бактериальных культур в пределах таксонов низкого уровня. Плсоморфизм, чрезвычайная фенотипическая изменчивость нокардиоформ приводит к обилию нечетких формулировок дифференцирующих признаков в приводимых диагнозах таксонов. Поэтому остается актуальным поиск объективных дифференцирующих тестов родококков, хорошо воспроизводимых при практической диагностике и определяемых доступными методами; разработка новых подходов в изучении родства этих культур на уровне вида; новых методов детекции и ускоренной идентификации конкретных штаммов не только в чистых культурах, но и в составе сообществ; накопление дополнительных сведений о свойствах уже известных видов и описание новых с обязательным привлечением не только коллекционных штаммов, но и природных изолятов. Валено изучение биологических особенностей широкого набора "диких" штаммов, ибо это дает возможность не только подтвердить на их примере объективность предложенных ранее и новых дифференцирующих критериев, но и выявить признаки, связанные с экологической специализацией исследуемых микроорганизмов и коррелирующие с их поведением in situ.
Данные, основанные на определении последовательностей 16S рРНК ряда представителей Rhodococcus spp. и подтвержденные комплексом хемотаксономических признаков (содержание ГЦ-оснований в ДНК, состав миколовых кислот и менахинонов, наличие индивидуальных липидов), показали их обособленное положение в родовой структуре сем. Nocardiacea (Stackebrandt et al, 1988; Goodfellow, 1989). Однако немотивированный выбор модельных штаммов не позволяет распространить полученные выводы на все множество описанных видов родококков. Охват в рамках единого метода всего разнообразия видов Rhodococcus, представленных в коллекциях мира, не осуществлен до настоящего времени. В отоге систематика данной группы организмов носит незавершенный характер. Насущной задачей остается поиск универсального подхода в изучении родства бактериальных культур на уровне вида, предварительного выявления внутривидовых группировок и объективного выбора штаммов - представителей конкретных видов (групп) для последующего детального генетического анализа.
Все вышесказанное (недостаточная изученность уникального видового разнообразия и потенциальных возможностей родококков, обеспечивающих их функционирование в специфических биотопах, возможность интродукции родококков в открытые экосистемы и биотехнологические аспекты изучения родококков) свидетельствует об актуальности дальнейшего углубленного изучения биологии и систематики бактерий рода Rhodococcus. Основой для развития подобных исследований должны служить специализиро-
ванные центры живых культур с детально описанными биологическими характеристиками. Коллекционные фонды бактерий рода Rhodococcus весьма ограничены (Sugawara et al, 1993). Полезность родококков как удобных объектов развивающейся биотехнологии обусловливает необходимость расширения коллекций этих ценных культур и совершенствование методов их сохранения.
Состояние вопроса, цель и задачи исследований. К началу наших исследований (1975 г.) биология нокардиоподобных бактерий, объединяемых в комплекс "rhadochrous" и выделенных недавно в самостоятельный род Rhodococcus (Zopf 1891) Goodfellow and Alderson 1977, была изучена слабо, в неудовлетворительном положении находилась систематика данных организмов, идентификация выделенных из природы штаммов была крайне затруднительна, отсутствовали эффективные методы выделения и учета изучаемой грз'ппы организмов in и ex situ. Невыясненными оставались экологические закономерности расселения родококков, характер их взаимодействия со средой обитания и сопутствующей микрофлорой, оценка физиологических функций в природных экосистемах.
В большей степени эти аспекты касались представителей нокардиоформ, усваивающих тяжелые газообразные углеводороды (Сз-СД Впервые установленная Г.АМогилевским нефтегазопоисковая информативность пропан- и бутанокисляющнх бактерий, входящих в состав "бактериального фильтра" на пути миграции газообразных углеводородов от залежи к дневной поверхности, способствовала широкому внедрению в практику разведочных работ геомикробиологического метода поисков нефтяных и газовых месторождений. Для усовершенствования микробиологического прогнозирования подземных залежей нефти и газа необходимо было разработать методы точного и быстрого распознавания индикаторной микрофлоры. Оказалось, что к ней относится множество ранее описанных под другими названиями нокардиоформ, систематическое положение которых требовало тщательной ревизии с привлечением новых нетрадиционных подходов и методов. Изучение биологических особенностей данной группы организмов, ее приуроченности к нефтегазоносным провинциям необходимо было для обоснования теоретических и практических положений нефтегазопоисковой микробиологии. Существенный практический интерес представляло изучение биоразнообразия газоокпсляющих бактерий подземных вод и почв районов нефтяных месторождений Пермского Предуралья, являющегося одним из перспективных нефтегазоносных районов Европейской части Российской Федерации.
Решение обозначенных проблем было возможным только на основе обязательного получения разнообразных чистых лабораторных культур и формирования реферативной коллекции, ибо каждый шгамм несет в себе важную часть генетического пула природных микробных сообществ, а ценность коллекционных культур возрастает по мере накопления все новой информации о их свойствах
Целью настоящей работы являлось комплексное изучение экологии и биологических особенностей, таксономии и деструктивных возможностей родококков, включая: (а) разработку фундаментальной базы данных о биологии алканотрофных родококков природных биоценозов, (б) поиск модельных штаммов, перспективных для биотехнологии; (в) создание профилированной коллекции чистых жизнеспособных культур и автоматизированного банка данных, пригодного для использования в коммуникационных сетях международного, регионального и национального назначения.
Основные задачи исследований:
1. Анализ природного разнообразия Rhodococcus spp. по видовым и экологическим критериям, включающий расшифровку состава сопутствующей газоокисляющим родо-коккам микрофлоры и усовершенствование методов эффективного выделения родокок-
ков из природных субстратов; изучение сезонной динамики представителей отдельных таксономических групп; крупномасштабное выделение культур родококков из различных природных субстратов контрастных околого-географических регионов; определение ан-тагонистичесюгх и патогенных свойств у отдельных представителей рода Ююс1ососсих.
2. Определение основных закономерностей распространения ШкхЬсоссия врр. и их численности в водных и почвенных экосистемах, в том числе газоиспользующих родококков в грунтовых и подпочвенных отложениях нефтеносных и ненефтеносных районов. Микробиологическое обследование природных экотопов для подтверждения применения микробиологического метода прогнозирования нефтяных и газовых месторождений. Оценка эффективности использования пропап-и бутанокисляющих родококков как биоиндикаторов при поисках нефти и газа.
3. Исследование таксономической структуры рода Ююс1оспсс1щ. Поиск новых дифференцирующих критериев и уточнение диагнозов видов. Характеристика родококков по их белковым спектрам. Разработка оптимальной схемы видовой идентификации родококков, пригодной в крупномасштабных таксономических исследованиях и при скрининге практически ценных штаммов.
4. Оценка возможности применения экспрессных иммунохимических методов для объективной диагностики известных видов родококков в чистых, накопительных культурах и смешанных природных популяциях. Разработка способа получения специфических иммунных сывороток против бактерий рода ШюЛососсих, приготовление чувствительных и специфических диагностических препаратов, определение иммуногенности и антигенной специфичности исследуемых штаммов.
5. Изучение структурных и функциональных изменений родококков в условиях индуцированного алканотрофного метаболизма, в частности сравнительное исследование количественного и качественного состава экстрацеллюлярных аминокислот, аотибиоти-кочувсгвительности, жирно-кислотного состава, поверхностных структур, ультратонкого и антигенного строения клеток родококков, культивируемых на разных питательных средах.
6. Изучение биосинтетической, деструктивной и трансформирующей активности выделенных штаммов родококков. Отбор штаммов-активных биодеструкторов различных классов приоритетных органических загрязнителей. Поиск продуцентов экологически безопасных биосурфактантов, перспективных для биотехнологии защиты окружающей среды. Разработка метода эффективного выделен™ поверхностно-активных комплексов родококков и исследование их эмульгирующей активности. Проверка нефтеотмывающих свойств биосурфактантов в условиях полевых экспериментов по биоремедиации нефте-загрязненной почвы.
7. Формирование детально охарактеризованного генофонда алканотрофных родококков и подготовка научной информации на основе новой версии ККС-кода в виде компьютеризированной базы данных о поддерживаемых коллекционных штаммах. Разработка оптимальных методов консервации чистых идентифицированных культур Л/гоа'ососсгм' эрр. с сохранением их уникальных биологических характеристик.
Научная новизна. С позиции системного подхода исследованы биологические особенности бактерий рода ШюЛососсих и своеобразие их взаимотношений с внешней средой, получен ряд уникальных данных, восполняющих познание биологии алканотрофных родококков Работа такого масштаба - с полным набором валидных видов родококков и обширным массивом природных штаммов - проведена впервые. В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие научные положения.
Родококки - экологически гетерогенная группа эубактерий, широко распространенных в природе, занимающих сложную систему экологических ниш - от богатых питательными веществами (организм человека и животных) до олиготрофных мест обитания
(грунтовые воды, снег, воздух и пр.) - и обладающих высоким уровнем адаптации к экстремальным условиям существования. По экологической принадлежности родококки могут быть охарактеризованы как диссипотрофы, использующие рассеянные источники питания и низкие концентрации органического субстрата.
Определенные виды родококков, благодаря их экологически важной способности метаболизировать в качестве единственных источников углеродного питания газообразные н-алканы (пропан, и-бутан), недоступные для друпгх микроорганизмов, характеризуются строго локальным распределением в природе и занимают доминирующее положение в естественном биоценозе "бактериального фильтра" районов углеводородных скоплений, представляющего собой своеобразный природный катаболический экран, предотвращающий загрязнение атмосферы газообразными углеводородами. В результате исследования обширного природного материала (образцы керна, пластовых и поверхностных вод, почв, снежного покрова, воздуха), отобранного из резко контрастных климатических зон, и стационарных исследований закономерностей распределения родококков в природе выявляется приуроченность отдельных видов Rhodococcus-. R.ery1hropolis, R.rhodochrous, R.ruber, R.opacus, R.^longus" к районам углеводородных скоплений. Доминантные виды R.rnber и R.rhodochrous рекомендуются как биоиндикаторы газовых углеводородных "аномалий".
Определению границ предпочтительного расселения конкретных видовых популяций родококков способствуют разработка и использование метода прямого исследования разнообразия Rhodococcus spp. в гетерогенных местообитаниях на основе иммунофлуо-ресцентной микроскопии. С использованием непрямого метода флуоресцирующих антител возможно изучение многообразия алканотрофных родококков in situ без традиционной необходимости выделения их в чистую лабораторную культуру в составе смешанных микробных сообществ на уровне численности популяции 10""-104 клеток/мл(г) в присутствии клеток/мл (г) сопутствующей микрофлоры. Одними из доминирующих бактерий-спутников родококков наряду с исевдомонадами являются представители родов Ко-сипа и Micrococcus.
Дифференциация видов родококков в пределах рода весьма затруднительна. Проведенные исследования указывают на возрастающий разрыв между полифазной таксономией и практической идентификацией изучаемой группы организмов, на отсутствие физиологически обоснованных и информативных, относительно простых по выполнению дифференцирующих тестов и необходимость изучения обширных рабочих коллекций культур. Для различения близкородственных видов родококков эффективным оказываег-ся применение разработанных расширенных диагнозов таксонов Rhodococcus, ключа, диагностической таблицы и оптимальной схемы видовой дифференциации Rhodococcus spp., включающей в качестве надежных диагностических маркеров таксономически значимые антибиотики, свободные жирные кислоты и характеристики спектров суммарных клеточных белков. Методы нумерического и кластерного анализа протеинограмм позволяет успешно дифференцировать и идентифицировать виды родококков.
В таксономическом изучении труднодифференцируемого таксона Rhodococcus имеет смысл применение методов иммунохимического анализа, позволяющих с большой достоверностью проводить экспрессную видовую диагностику родококков на основе их антигенных характеристик. Это открывает принципиальную возможность использования в качестве арбитра видовой идентификации чистых культур Rhodococcus spp. метода им-мунодиффузионного анализа, сочетающего преимущества высокой чувствительности и специфичности с простотой исполнения и доступностью. Для направленного поиска, экспрессной индикации и дифференциации родококков в естественных ассоциатах наиболее результативными и достаточно простыми являются методы иммунофлуоресцентного анализа. Высокоактивные поликлональные иммунные сыворотки, полученные по разработанным рациональным схемам против большинства известных видов Rhodococcus, позво-
ляют впервые провести детальный антигенный аналш штаммов всех валидных видов ро-дококков.
Родококки являются микроорганизмами, высокоадаптированными к использованию предельно восстановленных водонерастворимых субстратов (высших газообразных гомологов метана и жидких 7/-алканов). Полученные ранее неизвестные данные о структурно-функциональных изменениях клеток родококков в присутствии н-ал каков, как то. гиперсинтез мембранного аппарата, клеточной стенки, и новые сведения о жирно-кислотном составе, антибиотикочувствительности и антигенной структуре родококков, культивируемых на разных средах, свидетельствуют о своеобразии струетурной и метаболической организации их клеток. Углеводородный тип питания обусловливает впервые экспериментально доказанное возрастание антибиотикорезистентности родококков, сопровождающееся повышением содержания суммарных клеточных липидов, насыщенных прямоцепочечных жирных кислот (Cis.o, Cis:c, С21.0) и появлением в составе фосфолипи-дов кардиолипина и фосфатидилглицерина. Исследованные механизмы резистентности связаны с увеличением активности неспецифических окислительных ферментных систем родококков, инактивирующих воздействующие антибиотики. В условиях переключения газоокисляющих родококков с углеводного на углеводородное питание выявляются функциональные антигены (впервые обнаруживаемые с помощью реакции двойной им-мунодиффузии в агаровом геле), наличие которых подтверждает адаптивную природу ферментов окисления м-алканов, формирующихся только после появления данного субстрата в среде.
Практическая ценность. Создана наиболее полная в стране и за рубежом коллекция чистых идентифицированных культур Rhodococcus (378 штаммов, принадлежащих к 12, из них 9 валидным видам) и компьютеризированная база данных, используемая в каналах Internet (http:Www.bdt.org br\cgi-bin\msdn\iegm). Авторское собрание штаммов послужило основой для развития первой Региональной профилированной коллекции алка-нотрофных микроорганизмов, зарегистрированной (сентябрь, 1996) во Всемирном центре данных о микроорганизмах (World Data Centre for Microorganisms - WDCM), Всемирной федерации коллекций культур (World Federation for Culture Collections - WFCC) и вошедшей в мировой фонд коллекций.
Впервые создан банк специфических иммунных сывороток против большинства известных видов Rhodococcus. Разработки, связанные с детекцией и видовой идентификацией Rhodococcus spp. с помощью иммунохимического анализа (типовые антисыворотки, приготовленные на их основе тест-системы "антиген-антитело", усовершенствованный способ получения высокодисперсной эмульсии антигенов бактериальных штаммов в адъюванте), могут быть использованы в экспериментальной практике экспресс-диагностирования данной группы микроорганизмов (в том числе оппортунистических патогенов) в аналитических лабораториях, в работе микробных коллекций, экологических исследованиях родококков и для контроля за контаминацией лабораторных и производственных культур.
С помощью предложенных схемы видовой дифференциации родокококков, дополнительных критериев для различения близкородственных видов Rhodococcus, хемо-таксономического и иммунохимического анализа установлена видовая принадлежность пяти ранее неидентифицированных культур Rhodococcus sp. и реклассифицированы три штамма, полученные из Национальных коллекций промышленных и морских бактерий (NCTMB, Абердин, Великобритания), а также пересмотрено систематическое положение восьми штаммов-деструкторов эфиров о-фталевой кислоты, полученных из коллекции микробных культур ИНМИ АН Белоруссии.
Подобраны штаммы-активные продуценты незаменимых аминокислот, новых био-сурфактантов, культуры родококков с высокой активностью оксигеназного комплекса, в
том числе наиболее продуктивные пропан-и бутанокисляющие штаммы; представлены рекомендации по их эксплуатации. У данных штаммов установлено отсутствие патогенных свойств. Для эффективного выделения поверхностно-активных комплексов родокок-ков разработан оригинальный метод, включающий экстрагирование биосурфакгантных комплексов метил-третичнобутиловым эфиром в режиме ультразвукового озвучивания.
Разработанные эффективные питательные среды для преимущественного выделения газоокисляющих родококков из природных субстратов, обеспечивающие высокий селективный индекс (85-98 %), рекомендуются для выделения газоокисляющих родоккок-ков из смешанных природных и промышленных популяций.
Разработанный экспресс-метод диагностики пропан- и бутанокисляющих бактерий (удостоен диплома Ш степени и бронзовой медали ВДНХ СССР) и рекомендованная бактериальная индикаторная система обнаружения углеводородных газов в естественных субстратах используются в производстве нсфтегазопоисковых работ. По результатам комплексных поисково-геохимических и микробиологических исследований (1988-1992 гг.), проводимых на договорных условиях с Геофизической экспедицией по заказу ПО "Белорусгеология", в 1992 г. разбурено шесть структур, на двух из которых вскрыты промышленные залежи нефти, на двух других отмечены хорошие признаки нефтеносности, на остальных - нефтегазоносные отложения заводнены и только поэтому не представляют промышленной ценности.
Приобретен уникальный опыт работы с массовыми культурами алканотрофных микроорганизмов. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского госуниверситета: материалы диссертации используются в лекциях спецкурсов "Систематика прокариотных организмов" и "Нефтяная микробиология", культуры - в Практикуме по идентификации бактерий. Для обучения и исследовательских целей чистые культуры предоставлены в Государственную сельскохозяйственную академию, Государственную фармацевтическую академию (Пермь, Россия), Государственный университет (Санкт-Петербург, Россия), Ярославский государственный университет им. П.Г.Демидова, ИМВ АН Украины (Киев, Украина), ИНМИ АЛ Белоруссии (Минск, Белоруссия), Напиер университет (Эдинбург, Великобритания), Варвикский университет (Ковентри, Великобритания), Институт микробиологии (Аахен, Германия); "NC1MB (Абердин, Великобритания).
Связь работы с крупными программами. Работа в течение 1976-1997 гг. проводилась в соответствии с планом ПИР ИЭГМ УрО РАН (номера госрегистрации тем НИР 01.9.00 017993; 01.9.70 005279), а также в 1988-1990 гг. по заданию 5.5.5.1 Комплексной программы НТП СЭВ "Создание информационных банков данных о штаммах микроорганизмов"; в 1991-1993 гг. - в рамках целевого Международного проекта "Микробные ресурсы-биотехнологии" согласно договора о сотрудничестве с Международной информационной сетью данных о штаммах микроорганизмов и клеточных линиях (Microbial Strain Data Network - MSDN, Cambridge, (Ж); в 1992-1997 гг. - ГНПТ РФ "Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии"; в 1993-1995 гг. - ГППТ РФ "Биотехнология защиты окружающей среды"; в 1995-1997 г. - Региональной комплексной научно-технической программы "УРАЛ"; в 1994-1997 гг. - инициативных совместных проектов с Напиер университетом (Эдинбург, Шотландия) при поддержке Королевского научного общества Великобритании (The Royal Society, UK) и Международной программы НАТО "The NATO Sciences Programme and Cooperation Parthers" В 1993 г. исследования были поддержаны грантом РФФИ 93-04-12191, стипендией Джорджа Сороса и Академии естественных наук РФ по проблеме "Бноразнообразие". Реализация методических разработок по изучению "бактериального фильтра" нефтегазоносных районов и усовершенствованию метода микробиологического прогнозирования
подземных залежей нефтяных и газовых месторождений осуществлялась в ПО "Пермнефть", "Удмуртнефть", "Центргеофизика", "Аэрогеология", и "Келорусгеология" путем выполнения опытно-методических исследований на основе хоздоговоров (19791993 гг.) и выдачи практических рекомендаций в отчетах. Проверка информативной ценности применения экспрессных методов иммунодиагностики Rhodococcus spp.n Micrococcus spp. проводилась в рамках Договоров о сотрудничестве с Институтом микробиологии и вирусологии имени акад. Д.К.Заболотного АН Украины (1979-1982; 1982-1986; 19861987) и Института микробиологии АН Белоруссии (1989-1991).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на YI, YII Съездах Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980, Алма-Ата, 1985); Региональной конференции "Экология, человек и проблемы окружающей среды" (Свердловск, 1983); Выставке достижений народного хозяйства СССР (Москва, 1984, свидетельство ВДНХ СССР N. 17672 от 11.11.84); YI, YII, IX Международных симпозиумах по биологии актиномицетов (Дебрецен, 1985, Токио, 1988; Москва, 1994); Всесоюзной конференции "Биоиндикация и биотестирование природных вод" (Ростов-на-Дону, 1986); Всесоюзных конференциях "Биосинтез вторичных метаболитов" (Пущино, 1987, Ташкент, 1988), ХШ, X1Y Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Звенигород, 1988; Черноголовка, 1992); Ш Всесоюзной конференции "Биодинамика почв" (Таллин, 1988); Y Международном симпозиуме по микробной экологии (Киото, 1989); IY, Y Конференциях- Европейской актиномицетной группы (Удине, 1990, Париж, 1993); Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1991); 1, Ш Международных симпозиумах "Проблемы токсикологии и прикладной экологии" (Ленинград, 1991; 1995); Рабочем совещании Отделения общей биологии РАН "Биоразнообразие: систематическая изученность таксонов органического мира я формирование компьютеризированных банков данных" (Москва, 1991); Международном симпозиуме по микробиологии подземных экосистем (Бат, 1993); Конференции Российского микробиологического общества "Биосинтез ферментов микроорганизмов" (Москва, 1993); Конференции Европейской Федерации микробиологических обществ "Идентификация бактерий современные направления, перспективы на будущее" (Гранада, 1993); IY Конференции РФ "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994); YI1 Международном микробиологическом конгрессе (Прага, 1994), Международной конференции памяти акад. А.А.Бабаева (Москва, 1996); Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, сохранение, экологические проблемы" (Пермь, 1996), Международной конференции по биоремедиации (Портсмут, 1996); Y1I Международном конгрессе по коллекциям культур (Вельдховеи, 1996).
Публикации. Полученный экспериментальный материал и литературные сведения по теме диссертации обобщены в 73 печатных работах и частично в виде диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук (1982). Большая часть материалов представлена в двух монографиях (1987, 1988). Проведенная систематическая ревизия собранного генофонда бактериальных культур, сопровождающаяся постановкой большого объема экспериментальных исследований для подтверждения видовой принадлежности и исходной активности штаммов, завершена составлением и изданием (на русском и английском языках) "Каталога штаммов региональной профилированной коллекции ач-канотрофных микроорганизмов", М.: Наука, 1994. В опубликованных в соавторстве работах личный вклад автора заключался в планировании и непосредственном участии при выполнении экспериментов, обработке полученных результатов, их обсуждении и написании текста рукописей. Материалы диссертации вошли в опубликованные Программы специальных курсов для студентов биологического факультета ПТУ "Систематика прока-риотных организмов" и "Нефтяная микробиология" (Пермь, Перм. ун-т, 1997).
Место проведения работы. Материалы диссертации получены автором за время работы в лаборатории геологической микробиологии Института экологии растений и животных УНЦ АН СССР с 1975 по 1987 гг. и в последующий период (с 1988 г. по настоящее время) в лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, организатором и руководителем которой является автор работы Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала, базируются на результатах собственных исследований автора, режимных наблюдениях, опытно-методических испытаниях разрабатываемых методик, реализованных как в полевых, так и в лабораторных условиях. Большая часть используемых: в работе природных штаммов выделена и идентифицирована автором.
Исследования были начаты под руководством д.г.-м.н. A.A.Оборина и д.м.н., профессора Р.А.Пшеничнова. Изучение ультратонкого строения родококков проведено совместно с к.б.н. Л.Е.Глазачевой и к.б.н. В.П.Шеховцовым. Раздел работы по получению антисывороток выполнен при использовании вивария Пермской государственной медицинской академии. Проверка способности культур использовать эфиры фталевых кислот - основных загрязнителей сточных вод производства пластификаторов осуществлена совместно с сотрудниками лаборатории экологии микроорганизмов ИНМИ АН Белоруссии (зав. - д.б.н. А.С.Самсонова). При оценке вирулентности культур пользовались квалифицированными консультациями сотрудников кафедры патологической анатомии и биологической химии ПГМА. Генетический анализ родококков с использованием полимераз-иой цепной реакции проведен на базе Напиер университета (Эдинбург, Великобритания) при непосредственном участии д-ра К.Белла и н.с. М.С.Куюкиной. Работа по подготовке автоматизированной базы данных выполнялась на основе программного обеспечения, предложенного ИБФМ РАН (отделы ВКМ, ЦВТ). Ряд специальных задач решался на базе других научных подразделений ИЭГМ УрО РАН: лаборатории биохимии развития микроорганизмов (зав.- к.м.н. В.ПКоробов), лаборатории химического мутагенеза (зав.-к.мн. В.А.Демаков).
Автор выражает искреннюю благодарность названным коллективам и сотрудникам лабораторий геомикробиологии и алканотрофных микроорганизмов, способствующим завершению настоящей работы и чей вклад в определенные разделы исследований отражен в приведенных в списке литературы публикациях. Особую благодарность автор выражает коллективу лаборатории алканотрофных микроорганизмов за сотрудничество на всех этапах данной работы. Автор искренне признателен д.м.н., профессору Н.Н.Кеворкову за предоставленную возможность проведения экспериментов по изучению иммуногенности родококков на базе кафедры биохимии ПГМА, стимулирующие дискуссии, обсуждение разделов работы по серодиагностике родококков, ценные замечания и советы; к.м н. В.П.Коробову - за консультации и помощь при обработке результатов по разделению внеклеточных аминокислот способом ионнообменной хроматографии, постоянное внимание к настоящей работе, полезные советы и сделанные критические замечания; к.м.н. М.Колотову - за первоначальную помощь при лиофилизации культур и бактериальных диагностикумов. Автор благодарит сотрудников Напиер университета Великобритании во главе с профессором Н.Кристофи за плодотворное сотрудничество.
Автор приносит глубокую благодарность и признательность чл.-корр. РАН, д.б.н., зав. отделом ВКМ ИБФМ РАН, профессору Л.В.Калакуцкому за консультационную и практическую помощь, постоянное внимание и моральную поддержку при разработке концепции профиля первой на Урале коллекции микробных ресурсов и в ее практической организации.
Автор считает своим долгом выразить особую благодарность своим учителям и наставникам д.б.н. О А.Нестеренко!, д.м.н., профессору Р.А.Пшеничнову, д.м.н., профессору Н.Н.Кеворкову и д.г.-м.н. А.А.Оборину, оказавшим большое влияние на выбор целей научного поиска и формирование научного мировоззрения автора.
Автор выражает большую и искреннюю благодарность директору ИЭГМ УрО РАН, академику РАН, д.м.н., профессору В.А.Черешневу за помощь в работе в качестве научного консультанта и в его лице всем сотрудникам института, способствующим развитию Региональной профилированной коллекции чистых культур алканотрофных микроорганизмов.
1. Головлев Е.Л. Биолотя сапрофитных ыикобактерии. Автореф. дне. . докг. биол. паук. Путщшо: 1983, 37 с.
2. Калакуцкий Л.В. // Микробиология. 1993,62,2, 363-366.
3. Нестеренко О А., Квасников E.H., Ногина Т.М. Нокардшгаодобныс и корцнеподобные бактерии. Киев: Наук. думка, 1985. 336 с.
4. Ainann, R.I.. Ludwig, W.. Schleifer. K..-H. // Mierobiol.Rev., 1995. 1. 143-169.
5. Briglia. M., Rainey, F.A.. Stackebrandt, E. ei nl. ii Int. J.Syst. Bacteriol., 1996. 46. 1. 23-30.
6. Bull. A.T.. Hardmaa D.J. /7 Curr. Opm. Biolecbnol.. 1991, 2. 421-428.
7. Collins. M.D., Smida, J., Dorsch. M„ Stackebrandt, E. //Int. J. Syst. Bacteriol, 1988. 88, 385-391.
8. Convention oil Biological Diversity. // Biol.lnt, 1992, 25. 22-39.
9. Council Directive 93/88/EEC on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work // Official Journal of tile European Communities, No L 268/71 of 29.10.1993.
10. Emmons, W.. Rcichwein, В., Winslow. D.L. //Rev. Infect. Dis.. 1991, 13, 91-96.
11. Fiimerty, W.R. // Ann. Rev. Microbiol., 1992,46, 193-218.
12. Global Biodiversity Strategy. Policy-makers'guide. World Resources Institute, The World Conservation Union; United Nations Environment Programme: with consult. FAO and UNESCO. 1992, 52 pp.
13. Goodfellow, M. /I In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Eds. S.T.Williams et nl., Williams and Wilkins, Baltimore, 1989,2362-2371.
14. Hawksworth, D.L., Aguirre-Hudson. B. // In' The Biodiversity of Microorganisms and the Role of Microbial Resource Centres (B.Kirsop and D.L.Hawksworth cds.). WFCC.UNEP. 1994.65-72.
15. Hawksworth, D L„ Colwell, R.R. // Biol. Int.. 1992, 24,11-15.
16. Hawksworth. D L.. Sastramihardja, I, Kokke, R., Stevenson, R. Guidelines for the Establishment and Operation of Collections of Cultures of Microorganisms. Richmond, Surrcv: Simworth Press. 1990, 16 pp.
17. Klattc, S.. Jahnke, K.-D.. Kroppenstedt, R.M. el at. ,7 hit. I System. Bactcriol.. 1994. 44.4.627-630.
18. Klatte, S., Kroppenstedt. R.M.. Ramey,F. // J. Syst. Appl. Microbiol., 1994a. 17,355-360.
19. Microbial Diversity 21.1UMS/IUBS Action Statement. WFCC Newsletter, 1991. 17. 18-20.
20. Prescott, J. F. // Clin. Microbiol. Rev.. 1991, 4, 20-34.
21. Ramev, F.A.. Burghardt. I., Kroppenstedt. R., Klatte, S.. Stackebnmdt, E. U Int. I. Syst. Bacterid.. 1995.45. 101-103."
22. Raincy, F. A.. Klattc. R.M., Stackebrandt, E. // Int. J. Syst. Bacterid.. 1995a. 45, 1, 32-36.
23. Sands. P. // In: The Biodiversity of Microorganisms and the Role of Microbial Resource Centres (B.Kirsop and D.L Hawksworth cds.). WFCC.UNEP, 1994. 9-27.
24. Stackebrandt. E.. Sinida. J., Collins, M.D.//J. Gen. Appl. Microbiol.. 1988. 34. 4, 341-348.
25. Stoecker, M.A., Russell, P.H.. Stalcy. J.T. // Int. J. Svst Bacteriol.. 1994, 44. 1. 106-110.
26. Sugawara. H.. Ma, J., Miyazaki. S. et at. (eds.). World Directory of Collections of Cultures of Microorganisms. 4th cd. Saitama. WFCC World Data Center on Microorgamisms, RIKEN. Hirosawa, Japan. 1152 pp.
27. Warhurst, AM.. Fewson. C.A. // Crit. Rev. Biotechnology. 1994.1, 29-73.
L ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Рабочая коллекция культур, условия iiv выделения и культивирования. В работе использовано 378 чистых культур, выделенных в течение ряда лет из многих тысяч образцов пластовых, грунтовых и поверхностных вод, донных осадков, почв разных типов, вечномерзлых фунтов, кернов из геохимических скважин, снежного покрова, атмосферного воздуха контрастных природно-климатических зон, в том числе районов нефтяных загрязнений и нефтепромыслов России (Пермского Предуралья и Коми края, Таймыра и Западной Сибири, Ульяновского Поволжья и Красноярского края и т.д.) и нефтеразведочных площадей Белоруссии. Типовые штаммы известных видов Rhodococcus, Gordona, Dietzia,Micrococcus и Kocuria получены из Коллекции бактериальных культур отдела физиологии промышленных микроорганизмов ИМВ АН Украины и Национальных коллекций промышленных и морских бактерий (NCIMB), Абердин, Великобритания. Подготовка почвенных образцов включала предварительную обработку ультразвуком [69]. Алканотрофные микроорганизмы выделяли с помощью накопительных культур и культивировали на минеральных средах с углеводородными газами (пропаном, п-бутаном), н-гексадеканом и смесями жидких углеводородов (С15-С17, нефть; вазелиновое масло) в качестве единственных источников углерода и энергии, как описано ранее [9]. В качестве питательной среды для выделения газоокисляющих бактерий использовали также предварительно отстернл изо ванные через мембранные фильтры природные грунтовые воды. В работе использовали пропан (98,63 %) и я-бутан (99,75 %) производства Московского опытного з-да ВНИИгаз, жидкие индивидуальные //-алканы 97-99 % чистоты (Sigma Chemical Co., St Louis, USA). Для обнаружения и количественного учета в культуре накопления представителей рода Pseudomonas использовали элективные среды с апета-мидом (Вуль, Колкер, 1978; Atlas, 1993).
Исследуемые чистые культуры выращивали в течение 3 сут при 28°С на богатых питательных средах, как то; мясомептонный агар - МПА (Oxoid, Unipath Ltd, UK) и органический агар Гаузе N 2 (Поиск продуцентов. 1990), а также на жидкой и агаризовапной минеральной основе среды К (Малашенко и др, 1973), содержащей 1-2 об.% н-гексадекана в качестве единственного источника углерода и энергии. Пропанокисляющие родококки параллельно культивировали в течение 5-7 сут при 28°С на минеральной среде в газовоздушной атмосфере (пропан, я-бутан - воздух 1:5).
Стационарные наблюдения за динамикой популяции алканотрофных родококков в грунтовых водах проводили во время полевого сезона с мая по октябрь 1980 г. иа участках, расположенных в контуре Мазунинского нефтяного месторождения, за его пределами и в (контрольном) районе Ишимовской разбуренной непродуктивной структуры, в почвенных горизонтах - в период с июня по октябрь 1988 г. в районе Межевского месторождения нефти Пермской области Для определения содержания жизнеспособных клеток в популяциях различных видов родококков использовали метод микрокультурального анализа. Сравнительный анализ подземных вод на присутствие газоокисляющих бактерий и наличие растворенного газа проводили в полевых условиях на базе лаборатории ЛГМА-1 (автомобильной лаборатории геомикробиологии). Дегазацию водных проб и газовый анализ осуществляли по методике ВНИИЯГГ (Инструктивные указания. 1974). величины pH и Eh определяли непосредственно на водоисточнике с помощью ионометра И-102, количество растворенного кислорода - по методу Винклера, гидрохимические показатели - по общепринятой методике (Резников и др., 1970).
Таксономический анализ, изучение биохимической активности коллекционных и свежевыделенных культур, поиск модельных штаммов, необходимых для селекционных и биоинженерных работ, сопровождался постановкой большого набора тестов в соотвегст-
вии с. используемым в мировой практике RKC-кодом (Rogosa et а. 1986, McManus, Krichevsky, 1991).
Фснотипические исследования проводили по методам (Gordon, Smith, 1953; Gordon, Mihm, 1957; Sierra, 1957, Tsukamura, 1967, 1969; Komagata et cd., 1969) [58]. Морфологические признаки клеток, отобранных на разных стадиях роста культуры, исследовали методами световой, просвечивающей и сканирующей (с использованием микроскопов JEM-100B и JSM-50A, соответственно) микроскопии [10, 39,]. Морфологию клеток и цикл развития исследовали на живых препаратах 6, 18, 24, 48, 72 и 96-часовых культур, выращенных на скошенной питательной среде, методами световой микроскопии с использованием фазового контраста. Выявление метахроматических гранул и жироподоб-ных веществ, окраску по Граму и определение кислотоустойчивости проводили по общепринятым методам (Методы обшей. 1984).
Для дегсшии биомодифицирующей и деструктивной способностей штаммов использовали широкий спектр органических загрязнителей: газообразные (Сз-Сд), легколетучие (С5-С10), жидкие (Сц-Сп) я-алканы; ароматические углеводороды (бензол, толуол, ксилол); фенолы; эфиры фгалевых кислот; ароматические амины (анилин), кетоны углеводородов (ацетон), алифатические спирты (одноатомные: метанол, этанол, пропанол, бутанол, пентанол, октанол, двухатомные: полиэтилен гл и кол и, трехатомные: глицерин, щесгиатомные: дульцит, маншгг, сорбит), насыщенные жирные кислоты (моно- и дикар-боновые, циклические моно- и дикарбоновые, ароматические), жиры и масла (твин - 80, смазочно-охлаждающие жидкости); поверхностно-активные вещества (/9-алкамон, алкил-бензолсульфонат, алкилсульфонат, гидразекс-2), антибиотические вещества разного происхождения и спектра действия.
Хемотаксономичесюш анализ природных изолятов проводили с применением методов восходящей бумажной (наличие изомеров диаминопимелиновой кислоты - мезо-ДАПК и ÍX-ДАПК, моносахаридный состав клеток) и тонкослойной (наличие свободных миколовых кислот) хроматографии (Ногина и др., 1987, Becker el al., 1964, Lechevalier, 1968; Mmnikin el al, 1975) [60]. Препараты для изучения аминокислотного состава пепти-догликана готовили по методу (Schleifer, Kandier, 1972). Аминокислоты разделяли на автоматическом анализаторе "Biotronik 5001" на базе ИМВ АН Украины [44]. Тип пеггги-догликана определяли по количественному соотношению аминокислот пептидной части полимера.
Суммарные клеточные липиды, глико- и фосфолипиды экстрагировали по традиционному методу (Кейтс, 1975). Газожидкостной хроматографический анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили с помощью хроматографа модели "Chrom-5"c пламенно-ионизационным детектором, руководствуясь известным! методиками и рекомендациями (Goodfellow, Donnell, 1994) |51|. Исследование поверхностно-активных и эмульгирующих свойств родококков проводили при росте их на углеводных и углеводородных субстратах. Поверхностное и межфазное натяжение измеряли с помощью тенсиомеягра, критическую мицеллярную концентрацию биосурфактантов определяли разбавлением препаратов дистиллированной водой до достижения минимального значения поверхностного натяжения. Определение токсичности выделенных из родококков биосурфактант-ных комплексов проводили с помощью анализатора токсичности "Microtox Model М500" на базе Напиер университета по изменению интенсивности свечения биолюминесцентных бактерий Vibrio fischen при 15° С.
Электрофоретический анализ общих клеточных белков проводили в прерывистой по pH системе по методу Лемли (Laemmly, 1970) в аппарате для вертикального гель-электрофореза ("Хийу калур", Таллин). Экспериментально подобранные оптимальные условия постановки электрофореза в полиакриламидном геле предусматривали (1) отбор клеток в начале стационарной фазы роста, (2) разрушение их с помощью ультразвука в растворе додецилсульфата натрия со стеклянным порошком и (3) использование 9%-ного
геля. Белковые спектры сравнивали визуально попарно с подсчетом числа пар идентичных полос и общего числа полос в обоих спектрах. Процент сходства рассчитывали, сравнивая протеинограммы различных штаммов, с использованием коэффициента Чека-новского (Зайцев, 1991). На основании полученных электрофореграмм проводили кластерный анализ спектров суммарных клеточных белков с использованием показателей взвешенного среднего числа пары группы.
Нмяунохнмическнй анализ. Культуры выращивали на МПЛ при 28°С в течение 72-96 ч. При сравнительном изучении антигенного родства клеток газоокисляющих родококков последние параллельно культивировали на минеральной среде с пропаном 117]. Водорастворимые антигенные комплексы получали путем дезинтеграции клеток при помощи низкочастотного диспергатора УЗДН-М (22 кГц, 10 (для микрококков) - 20 (для родококков) мин в условиях охлаждения суспензии). Концентрация белка в гомогенатах, определяемая по методу (Lowry et al., 1951), составляла в среднем 25 мг/мл. Антигенную специфичность свежевыцеленных и коллекционных культур изучали в опытах перекрестной постановки реакций пробирочной агглютинации (РА), двойной иммунодиффузии в агаровом геле по Оухтерлонн (РИ). непрямой иммунофлуоресценции (нМФА), как описано ранее [12, 26, 31, 57]. Иммуногенность родококков исследовали по уровню определяемых у экспериментальных животных агглютининов и преципитинов.
В РА использовали антисыворотки, полученные против гретых вакцин, в РИ - как выше упомянутые, так и сыворотки, полученные против соответствующих гомогенатов бактериальных клеток В РЛ антигенами служили инактивированные прогреванием культуры в S-форме, в РИ - разрушенные ультразвуком. Для приготовления преципнтирую-щих антиродококковых сывороток предлагается усовершенствованный способ получения высокодисперсной эмульсии антигенов бактериальных клеток в адъювапте, предусматривающий дезинтеграцию клеток и создание эмульсии в адъюванте в одной пробе. С этой целью клетки обрабатываются ультразвуком в течение 15 мин, а затем в пробу добавляется адьювапт, и смесь дополнительно озвучивается на протяжении 5 мин. Поли-клональные иммунные сыворотки получали к типовым и типичным штаммам разных видов Rhodococcus и Micrococcus по разработанным способам оптимальной гипериммунизации кроликов [24). Титры антисывороток приведены в табл.1. Готовые антисыворотки хранили в лиофилизированном состоянии, а созданные на их основе референтные системы "антиген-антитело" - в замороженном виде с добавлением мертиолата (1:10 ООО). Контроль состояния банка иммунных сывороток и бактериальных диагностикумов проводили через каждые 6 мес. их хранения путем оценки титра и специфичности сохраняемых аитисывороток В нМФА использовали меченую изотиоцианатом флуоресцеина антикроличью сыворотку в рабочем разведении 1:4 производства ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Приготовленные препараты просматривали под люминесцентным микроскопом "ЛЮМАМ И-2" (не менее 10 полей зрения) с объективом 90 х, применяя в качестве иммерсионной среды химически чистый днметилфталат, контрастирующего красителя -бычий альбумин, помеченный родамином. Для нммунофлуоресцентного исследования искусственных сообществ использовали поливалентные (смесь нескольких типовых аитисывороток) иммунные сыворотки против различных видов Rhodococcus [61]. Искусственные микробные ассоциации включали суспензии чистых культур отдельных представителей Rhodococcus, Micrococcus и Pseudomonas, смешанные в равных концентрациях. Для оценки интенсивности специфической флуоресценции использовали общепринятую четырех крестную шкалу [34]. Положительным результатом иммунофлуоресцентных реакций считали флуоресценцию клеток интенсивностью не менее 3 + Количественный учет родококков проводили по методу (Cochran-Stafira. Starzyk, 1989). Преципитационные спектры исследуемых штаммов регистрировали зарисовками и фотографированием в ко-сопроходяшем свете.
Таблица 1. Титры антител полученных специфических поликлональных иммунных сывороток против типовых и типичных представителей Rhodococcus spp., Micrococcus spp.